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 賴(lài)心田，馮榮虎，張世偉，王士峰，楊國(guó)武* 

 深圳市計(jì)量質(zhì)量檢測(cè)研究院（深圳518102）

摘要通過(guò)核桃蛋白組分分析，確定核桃豐度蛋白。以其作為抗原免疫小鼠，制備可特異性識(shí)別核桃蛋白的單克隆抗體，建立間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法。篩選出一株能穩(wěn)定分泌抗核桃蛋白的雜交瘤細(xì)胞株HT-1,對(duì)間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法的反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化后，建立了檢測(cè)核桃蛋白的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，核桃蛋白的檢測(cè)線(xiàn)性范圍在4.6～64.2 μg/m L，IC50，為17.2 μg/m L，最低檢測(cè)限為(0.67 μg/m L�？贵w特異性較好，與其他的植物蛋白沒(méi)有交叉反應(yīng)。該方法適用于檢測(cè)核桃制品中的核桃蛋白含量。

關(guān)鍵詞  核桃：核桃蛋白：間接競(jìng)爭(zhēng)法ELISA

 核桃營(yíng)養(yǎng)豐富，是世界四大干果之一，是一種深受廣大群眾喜歡的食品。中國(guó)是核桃主要產(chǎn)區(qū)之一，面積產(chǎn)量居世界首位。數(shù)據(jù)顯示，每百克核桃含有26.1 g核桃蛋白。其中主要由4種蛋白質(zhì)構(gòu)成，為清蛋白、球蛋白、醇溶谷蛋白和谷蛋白，分別占核桃蛋白總量6.81%，17.57%，5.33%和70.1 1%。核桃蛋白中含有18種氫基酸，種類(lèi)齊全，且人體所需的8種必需氨基酸含量合理。對(duì)人體生理作用有著重要功能的谷氨酸、天冬氨酸和精氨酸含量較高。

 目前，以核桃為原料的各種加工食品越來(lái)越多的出現(xiàn)在了市場(chǎng)上。核桃蛋白飲料中核桃蛋白的含量造假的報(bào)道越來(lái)越引起關(guān)注。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 16322-2003“植物蛋白飲料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)”只能依據(jù)凱氏定氮法對(duì)其總蛋白進(jìn)行定量。三聚氰胺事件給依賴(lài)這一傳統(tǒng)的技術(shù)手段進(jìn)行蛋白檢測(cè)的方法敲響了警鐘。雖然，現(xiàn)在對(duì)三聚氰胺的控制卓有成效，但是對(duì)非法添加物的監(jiān)控仍然是針對(duì)已知的、具體的物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)。合成化學(xué)的飛速發(fā)展導(dǎo)致可以冒充蛋白質(zhì)的物質(zhì)眾多，制假者的手段也在不斷翻新，假如利用其它物質(zhì)冒充蛋白，現(xiàn)有技術(shù)很難發(fā)現(xiàn)。另外，一些廠(chǎng)商還有可能使用廉價(jià)的蛋白替代核桃蛋白，如在核桃乳中摻人大豆粉或花生乳。具體摻人多少也因缺乏檢測(cè)方法，全憑企業(yè)聲稱(chēng)。

 為探索一種能夠快速有效檢測(cè)核桃制品中核桃蛋白的方法，試驗(yàn)采用單克隆抗體技術(shù)和酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定等技術(shù)，制備抗原，篩選核桃蛋白單克隆抗體，旨在建立檢測(cè)食品中核桃蛋白含量的ELISA測(cè)定法。

1  材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1試劑

 新疆核桃：市售；免疫佐劑Qpickantibody:北京康碧泉公司；5周齡BALB/c小鼠：廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；SP2/0小鼠骨髓瘤細(xì)胞：實(shí)驗(yàn)室保存；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清和雙抗( Penicillin-StreptomycinSolution)：GIBCO公司。

 TMB、牛血清白蛋白(BSA)：sigma公司；HRP標(biāo)記山羊抗小鼠二抗：Proteintech公司；PAGE膠蛋白微量回收試劑盒：上海生工。其它試驗(yàn)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，實(shí)驗(yàn)室用水均為去離子水。ELISA其他溶液配方。

1.1.2儀器與設(shè)備 

蛋白電泳儀：Bio-rad；酶標(biāo)儀：Biotek，美國(guó)；96孔酶標(biāo)板和細(xì)胞培養(yǎng)瓶：Comning，美國(guó)；洗板機(jī)：Biotek，美國(guó)；電熱恒溫振蕩水槽：上海一恒；手持式酸度計(jì)：Beckman Coulter，美國(guó)。其他常規(guī)試驗(yàn)儀器。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1抗原及抗體制備

 核桃仁中脂肪含量很高，因此要先將其除去。破碎核桃，稱(chēng)取5g核桃仁，將其磨碎。加入20 m L石油醚，在室溫下脫脂0.5 h，之后離心去液體，重復(fù)脫脂3次，置于通風(fēng)廚風(fēng)干。稱(chēng)取1 g風(fēng)干的核桃末，加入10 m L 8 mol/L尿素，用勻漿器打成乳狀，得到核桃提取液。

 將核桃提取液進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，選用12%分離膠，5%濃縮膠。用5x的上樣處理液與核桃提取液混合；恒壓80 V，30 min，120 V，1 h；染色0.5h，脫色過(guò)夜。

 依據(jù)凝膠過(guò)濾的洗脫體積，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和斯托克斯半徑，研究者估算出核桃谷蛋白的相對(duì)分子量為48.68±26.95（平均值土標(biāo)準(zhǔn)偏差，n=4）。因此，切膠回收40 k D左右的條帶，用PAGE膠蛋白微量回收試劑盒回收。回收好的蛋白放人凍干機(jī)中凍干。凍干的粉末再用8 mol/L尿素溶解，用PBS稀釋后質(zhì)量濃度為200 μg/m L．和等體積的免疫佐劑QUickantibody等

體積混勻，大腿肌肉注射免疫100 Vg/只，第21天等劑量加強(qiáng)免疫，第35天后尾部采血檢測(cè)，測(cè)量血清多抗效價(jià)。單克隆抗體及腹水制備方法。

1.2.2  ELISA方法

 用棋盤(pán)滴定法確定ELISA的抗原包被濃度、一抗、樣品和酶標(biāo)二抗的稀釋倍數(shù)。其他ELISA條件：96微孔板每孔用100 μL，質(zhì)量濃度為10μg/m L核桃蛋白包被，4℃孵育過(guò)夜，次日棄上清液，用200μL含有2%BSA的PBST溶液37℃封閉2h，棄上清液，用PBST洗滌5遍拍干后，微孔板可密封4℃保存或者立即使用。

 間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA:取封閉好的微孔板室溫平衡30min，先加入50 VL標(biāo)準(zhǔn)液或檢測(cè)樣本稀釋液，再加入50μL單抗稀釋液，37℃反應(yīng)30 min，棄上清液，洗滌拍干后，加入HRP標(biāo)記山羊抗小鼠二抗100 μL，37℃反應(yīng)30 min，棄上清液，洗滌拍干后，加入TMB顯色液，避光37℃反應(yīng)10 min后，加入50 VL終止液終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀450 nm檢測(cè)吸光度。

1.2.3  ELISA方法的建立

 日常實(shí)際的核桃制品都是以水作為溶劑，因此標(biāo)準(zhǔn)品以水作為提取溶劑。將核桃破碎，稱(chēng)取5g核桃仁，將其磨碎。加入20 m L石油醚，在室溫下脫脂0.5h，之后離心去液體，重復(fù)脫脂3次，置于通風(fēng)廚風(fēng)干。稱(chēng)取1g風(fēng)干的核桃末，加入7 m L水進(jìn)行溶解，之后用勻漿器混勻，離心后的上清溶液即為核桃水溶性蛋白。用凱氏定氮測(cè)量可溶性蛋白含量，先用PBST倍比稀釋?zhuān)�按照�?yōu)化的ELISA條件進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)，每個(gè)濃度重復(fù)4次，建立logit-log回歸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1.2.4熱穩(wěn)定性與乳化劑影響

 核桃蛋白主要以球蛋白為主，在水中的溶解性差，對(duì)熱極為敏感，核桃乳在加工和存儲(chǔ)過(guò)程中易出現(xiàn)沉淀和脂肪上浮現(xiàn)象，在工業(yè)生產(chǎn)中會(huì)加入乳化劑來(lái)提高穩(wěn)定性。因此，試驗(yàn)?zāi)７潞颂胰榈募庸すに�，觀(guān)察這些條件是否對(duì)核桃蛋白的定量產(chǎn)生影響。在15μg/m L核桃蛋白液中加入0.1%的乳化劑，分別用巴氏殺菌法( 70℃，30 min)、100℃高溫處理和超高溫

瞬時(shí)滅菌( 121℃，5s)進(jìn)行處理，用ELISA方法進(jìn)行測(cè)定。

1.2.5  回收率與精密度

 在牛奶、花生乳及水溶液中加入100 Vg/g、10μg/g的核桃標(biāo)準(zhǔn)蛋白，計(jì)算添加回收率：回收率=測(cè)量值／添加值×100%。同理計(jì)算批內(nèi)和批間的變異系數(shù)：CV=標(biāo)準(zhǔn)差(STD)／均值(X)×100%。

1.2.6交叉反應(yīng)及實(shí)際樣品測(cè)定

 用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定其他蛋白樣品作交叉反應(yīng)試驗(yàn)，用PBS作為陰性對(duì)照。收集市場(chǎng)上的核桃制品，用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)核桃蛋白的含量。

2結(jié)果與分析

2.1抗原蛋白的制備

 將核桃蛋白提取后，用12%的膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果見(jiàn)圖1，通過(guò)電泳圖分析，核桃的豐度蛋白主要在20～40 k Da左右，最終選取高豐度的40 kD a蛋白作為抗原，通過(guò)膠回收試劑盒進(jìn)行回收純化。定量蛋白質(zhì)量濃度到1 mg/m L，作為抗原免疫小鼠。

2.2  ELISA條件優(yōu)化

 通過(guò)單克隆抗體的制備，篩選出特異性及親和力都較好的細(xì)胞株，命名為HT-1。采用棋盤(pán)法確定抗原包被濃度及-抗的稀釋倍數(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖2。最終確定核桃包被濃度為4μg/m L，單抗的稀釋倍數(shù)為1：20 000。

 由圖3可知，以橫坐標(biāo)x=1g（蛋白濃度），y=l n(B／B0)，得到抑制回歸曲線(xiàn)y=3.034 10-2.497 31x，相關(guān)系數(shù)R2=0.998 5，線(xiàn)性檢測(cè)范圍為4.6～64.2μg/m L，半數(shù)抑制濃度IC50=17.2 μg/m L，最低檢測(cè)限0.67 μg/m L。其中，B為PBST空白對(duì)照OD450，B為不同試驗(yàn)組OD450。

2.3  回收率與精密度檢測(cè)

 在牛奶和椰子乳中分別加入核桃蛋白，計(jì)算ELISA方法的回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。從表1可知，在牛奶中樣品的平均回收率為109%，在椰子乳中的平均回收率為101.7%，平均相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差值為5 .1%，最大值不超過(guò)10%，說(shuō)明該方法準(zhǔn)確度高，穩(wěn)定性好。

2.4熱穩(wěn)定性與交叉反應(yīng)

 用3種不同的加熱方式及乳化劑對(duì)核桃蛋白進(jìn)行處理，結(jié)果見(jiàn)表2。從表2可知，巴斯消毒、100℃高溫處理和超高溫瞬時(shí)滅菌在是否加入乳化劑的條件下所測(cè)的核桃濃度與實(shí)際的添加濃度差別很小，表明100℃高溫處理及乳化劑不會(huì)影響核桃抗原表位的識(shí)別，因此該方法可以用于檢測(cè)高溫及乳化處理的核桃制品。

 ELISA方法的特異性試驗(yàn)用交叉率表示，交叉率越高交叉范圍越大，說(shuō)明ELISA檢測(cè)的特異性越差。由表3可知，采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法評(píng)估抗體對(duì)幾種食品中常見(jiàn)蛋白和干擾物的交叉反應(yīng)。除了跟核桃有反應(yīng)外，其他植物蛋白反應(yīng)率低于1%，說(shuō)明此方法特異性良好，對(duì)食品幾種常見(jiàn)的蛋白無(wú)交叉反應(yīng)，不易出現(xiàn)結(jié)果誤判。

2.5  ELISA方法測(cè)定實(shí)際樣品中核桃蛋白濃度

 從深圳市場(chǎng)上購(gòu)買(mǎi)到3種核桃乳和4種核桃粉，由表4可知，其中2種核桃乳核桃蛋白濃度較高，樣品3是復(fù)合核桃乳，核桃只是其中一種成分，測(cè)得的核桃乳核桃蛋白含量很低，4種核桃粉的核桃蛋白濃度相對(duì)較低。由于核桃蛋白以球蛋白為主，在水中溶解性差，而日常的核桃制品都是水溶性為主，因此，核桃粉類(lèi)制品在實(shí)際檢測(cè)中核桃蛋白含量會(huì)相對(duì)較低。核桃乳經(jīng)過(guò)加工處理后核桃蛋白含量相對(duì)較高。

3結(jié)論

 試驗(yàn)以核桃制品摻假問(wèn)題作為出發(fā)點(diǎn)，通過(guò)單克隆抗體技術(shù)篩選出一株能特異性識(shí)別核桃可溶性蛋白的細(xì)胞株HT-1，建立間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法對(duì)核桃蛋白進(jìn)行定量。此方法檢測(cè)實(shí)際樣品穩(wěn)定可靠，不易受乳化劑及高溫的干擾，具有較好的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值和開(kāi)發(fā)成商品化試劑盒的潛力。目前，市場(chǎng)上核桃蛋白定量的試劑盒仍是空白，試驗(yàn)?zāi)軌驗(yàn)楹颂抑破返谋O(jiān)督提供一種高效穩(wěn)定的檢測(cè)方法，為廣大消費(fèi)者提供保障。