HPLC測(cè)定蝦皮中不同類型的生物胺
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程衛(wèi)，王艷偉，陳培云，吳廣臣，趙志磊*
河北大學(xué)質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督學(xué)院（保定071002）
摘要蝦皮是深受我國(guó)消費(fèi)者喜愛(ài)的食物和調(diào)味品，為分析蝦皮中生物胺含量及種類，利用高效液相色譜法對(duì)市售蝦皮中的生物胺含量進(jìn)行檢測(cè)。利用5%三氯乙酸溶液提取蝦皮中的生物胺，并采用丹磺酰氯進(jìn)行柱前衍生；Agilent TC-C18(5μm, 250 mm×4.6 mm)柱進(jìn)行分離，乙腈和水為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，熒光檢測(cè)器檢測(cè)，其中激發(fā)波長(zhǎng)336 nm,發(fā)射波長(zhǎng)495 nm。結(jié)果表明，蝦皮中生物胺有色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、酪胺、亞精胺及精胺等8種，在20 min內(nèi)8種生物胺得到很好的分離。經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，線性范圍為1～50 μg/m L，回收率在53%~183%，方法檢出限為1 μg/g; RSD在1,97%～3.56%。不同來(lái)源的樣品生物胺的含量及種類差異很大，可能與加工工藝有較大相關(guān)性，該方法靈敏度高，重現(xiàn)性好，可為測(cè)定蝦皮中生物胺含量提供技術(shù)支持。
關(guān)鍵詞 高效液相色譜法；生物胺：蝦皮
蝦皮是海產(chǎn)毛蝦（Acetes chinensis）整體的干制品，為中國(guó)沿海地區(qū)特產(chǎn)，其產(chǎn)量占全世界年產(chǎn)量的95%以上。蝦皮營(yíng)養(yǎng)豐富，每百克中含蛋白質(zhì)24.5g，脂肪2.5 g，糖6g，鈣1.7 g，并富含鈣、磷等礦物質(zhì)，素有“鈣的倉(cāng)庫(kù)”之稱。兒童常吃蝦皮有助于骨骼和牙齒的發(fā)育，中老年人多食蝦皮也有良好的保健作用，蝦皮是補(bǔ)鈣的營(yíng)養(yǎng)佳品。蝦皮不僅富含營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，還可用于各種菜肴及湯類的增鮮提味，是中西菜肴中不可缺少的海鮮調(diào)味品。蝦皮中含有豐富蛋白質(zhì)，然而蛋白質(zhì)經(jīng)微生物分解后，轉(zhuǎn)變?yōu)殡暮桶被�，進(jìn)而分解成低級(jí)胺和氨氣。胺易與蝦皮中的亞硝酸鹽反應(yīng)生成致癌性化合物亞硝胺。人體攝人過(guò)多生物胺時(shí)會(huì)出現(xiàn)頭痛、心悸、腹瀉和休克等中毒癥狀。目前，仍鮮見(jiàn)關(guān)于蝦皮中生物胺含量分析的報(bào)道。
生物胺是一類具有生物活性的含氮的小分子量有機(jī)化合物的總稱，主要是由相應(yīng)的氨基酸通過(guò)微生物的脫羧作用形成或由醛、酮類物質(zhì)，在氨基酸轉(zhuǎn)氨酶作用下產(chǎn)生。根據(jù)結(jié)構(gòu)可分為脂肪族、芳香族和雜環(huán)族。生物胺在機(jī)體內(nèi)有重要的生理活性和毒理效應(yīng)，但過(guò)量的生物胺對(duì)人體有直接的毒性作用，高劑量的攝入會(huì)使人出現(xiàn)呼吸困難、發(fā)熱、心悸、冒冷汗、紅色皮疹、口腔灼痛和血壓過(guò)低等癥狀。目前，國(guó)內(nèi)外報(bào)道的生物胺的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法、氣相色譜法、離子色譜法、薄層色譜法、毛細(xì)管電泳法及酶聯(lián)免疫法等。其中，高效液相色譜法具有分析速度快、柱效高、檢測(cè)靈敏度高和定量分析準(zhǔn)確的特點(diǎn)。試驗(yàn)利用高效液相色譜一熒光檢測(cè)器對(duì)蝦皮中的生物胺含量和種類進(jìn)行分析，為蝦皮的食用安全性及生物胺的安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供了技術(shù)支持。
1 材料與方法
1.1原料
1.1.1試劑與樣品
色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、酪胺、亞腈胺和精胺：標(biāo)準(zhǔn)品，純度均在97%以上；丹磺酰氯：標(biāo)準(zhǔn)品；三氯乙酸、鹽酸、氨水、氫氧化鈉和碳酸氫鈉：分析純；乙腈、甲醇和丙酮：色譜純；二次去離子水。
蝦皮樣品：市售。
1.1.2儀器與設(shè)備
高效液相色譜儀-熒光檢測(cè)器：美國(guó)Agilent 1100 Se ries；KQ-500E型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；Human超純水機(jī)：韓國(guó)Human；電子天平：AR1140，美國(guó)奧豪斯公司；飛鴿牌離心機(jī)：TGL-10C，上海安亭科學(xué)儀器廠；恒溫水浴鍋：B-260，上海亞榮生化儀器廠。
1.2試驗(yàn)方法
1.2.1試樣的處理
取10 g蝦皮樣品用于磨絞肉杯磨碎，稱取2.5 g置于25 m L具塞試管中，加15 m L 5%三氯乙酸溶液，超聲波提取30 min，用5%三氯乙酸溶液定容至刻度，混勻后取8 m L樣品液移至10 m L離心管中，離心20 min( 12 000 r/min，4℃)；上清液備用。
1.2.2試樣的衍生
取500μL濾液于棕色容量瓶中，依次加入200μL2 mol/L Na OH，300 μL飽和NaHC03溶液進(jìn)行緩沖。再加入1 m L 10 mg/m L的丹磺酰氯丙酮溶液，搖勻后置于60℃水浴鍋中反應(yīng)30 min，中間振蕩2次。取出冷卻后加入100μL氨水中斷反應(yīng)，室溫下靜置20 min。然后將容量瓶置于60℃水浴鍋中15 min，去除丙酮。取出冷卻后，用乙腈定容至5 m L容量瓶，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾后待測(cè)。每個(gè)樣品重復(fù)3次。制備好的樣品避光4℃保存待測(cè)。
1.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
1.3.1標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制
生物胺標(biāo)準(zhǔn)混合使用液的配制：分別稱取2.50 mg各生物胺單組分標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，置于同一個(gè)25 m L容量瓶中，用0.1 mol/L鹽酸溶液定容至刻度，混勻，配制成質(zhì)量濃度為100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，儲(chǔ)存于4℃冰箱中備用。
生物胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液的配制：準(zhǔn)確稱取各種生物胺標(biāo)準(zhǔn)品0.100 g，分別置于100 m L容量瓶中，用0.1 mol/L鹽酸溶液定容至刻度，混勻，配制成質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，儲(chǔ)存于4℃冰箱中備用。
1.3.2標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制
吸取0.10，0.25，0.50，1.00，1.50，2.50和5.00mL生物胺標(biāo)準(zhǔn)混合使用液，分別置于10 m L容量瓶中，用0.1 mol/L鹽酸溶液定容至刻度，混勻，使質(zhì)量濃度分別為1.00，2.50，5.00，10.0，15.0，25.0和50.0mg/L。然后按照1.2.2進(jìn)行衍生。
1.4色譜條件
色譜柱為Agilent TC-C18(5μm，250 mm×4.6mm)柱，柱溫30℃；流動(dòng)相A:水；流動(dòng)相B：乙腈；流動(dòng)相梯度洗脫方法見(jiàn)表1；流速1.0 m L/min;進(jìn)樣量20μL ；梯度洗脫時(shí)間30 min。
熒光檢測(cè)器的激發(fā)波長(zhǎng)為336 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為495 nm。
2結(jié)果與分析
2.1衍生試劑的選擇
由于生物胺既沒(méi)有熒光發(fā)色基團(tuán)，也沒(méi)有紫外發(fā)色基團(tuán)，采用HPLC方法進(jìn)行生物胺檢測(cè)時(shí)，一般需要柱前或柱后衍生。選擇合適的衍生試劑對(duì)于分析的準(zhǔn)確度和靈敏度十分重要。常用的柱前衍生試劑為丹磺酰氯或苯甲酰氯。丹磺酰氯具有衍生性、操作簡(jiǎn)單、衍生物穩(wěn)定性好、有較強(qiáng)的熒光和紫外吸收、基體干擾不明顯等優(yōu)點(diǎn)，而苯甲酰氯存在衍生時(shí)間長(zhǎng)、易與樣品中其它雜質(zhì)形成干擾峰及在前處理過(guò)程中需固相萃取等缺點(diǎn)。因此，試驗(yàn)采用丹磺酰氯作為柱前衍生試劑。
2.2樣品提取溶劑的選擇
由于蝦皮中含有豐富的蛋白質(zhì)，所以作為蝦皮中生物胺的提取溶劑需同時(shí)滿足2個(gè)條件： (1)生物胺在該溶劑中具有良好的溶解性。(2)該溶劑能沉淀蝦皮中的蛋白質(zhì)。常用的生物胺提取溶劑有三氯乙酸、高氯酸、鹽酸及甲醇。有研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于魚類、肉類、香腸、火腿及罐裝泡菜等樣品，三氯乙酸的除蛋白效果較理想，且凈化結(jié)果也較理想。而對(duì)于各種奶酪，鹽酸的除蛋白效果好。另有報(bào)道表明該4種提取溶劑在滿足快速、完全去除蛋白的前提下，凈化效果為：三氯乙酸>甲醇>高氯酸>鹽酸。圖1為生物胺標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖，圖2為用三氯乙酸作為提取溶劑時(shí)加標(biāo)蝦皮樣品的色譜圖。
由圖2可知，使用三氯乙酸作為生物胺提取溶劑，7種生物胺都能得到良好的分離。另外，經(jīng)優(yōu)化獲得的表1洗脫條件20 min內(nèi)，全部的待檢生物胺都能被洗脫出來(lái)，且各生物胺峰形對(duì)稱，因此認(rèn)為該條件能滿足蝦皮中生物胺的測(cè)定要求。
2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程、檢出限及定量限
分別吸取經(jīng)1.3.2處理后的待測(cè)樣品進(jìn)樣進(jìn)行HPLC分析，可測(cè)得不同質(zhì)量濃度生物胺標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積，以生物胺各質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)，相應(yīng)的峰面積為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程及相關(guān)系數(shù)（見(jiàn)表2）。
由表2可以看出，7種生物胺經(jīng)丹磺酰氯衍生后，其峰面積與質(zhì)量濃度有良好的線性關(guān)系，且各相關(guān)系數(shù)均大于0.997，方法的檢出限為1μg/g。以信噪比( S/N) >3作為檢出限的判斷標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，各生物胺的檢出限為0.01～0.08 μg/m L;以信噪比(S/N)>10作為定量限的判斷標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，各生物胺的定量限為0.04～0.2μg/m L。該方法靈敏度高，可以滿足分析要求。
2.4加標(biāo)回收率、精密度及穩(wěn)定性試驗(yàn)
準(zhǔn)確稱取4份等質(zhì)量的樣品于試管中，其中1份不添加生物胺，另外3份分別添加不同水平的生物胺標(biāo)液進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，樣品處理方法同(1.2.1及1.2.2)進(jìn)行處理。每個(gè)樣品平行測(cè)定2次，計(jì)算回收率，結(jié)果表明，7種生物胺的平均回收率分別為53%, 81%, 57%, 97%, 183%, 130%和171%（見(jiàn)表3）。
2.5市售蝦皮樣品中生物胺含量的測(cè)定
試驗(yàn)使用HPLC-FLD檢測(cè)法同時(shí)分離測(cè)定了蝦皮中色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、酪胺、亞精胺及精胺7種物質(zhì)。結(jié)果如表4所示。
由表4可知，市售的6個(gè)蝦皮樣品中共檢測(cè)到7種生物胺，其中，所有樣品中均含有腐胺、亞精胺及精胺。另外，不同蝦皮樣品中，生物胺的含量和種類差異較大。
在對(duì)編號(hào)4的衍生樣品連續(xù)進(jìn)樣7次的試驗(yàn)中，通過(guò)對(duì)比峰面積計(jì)算各組分的RSD在1.97%～3.56%之間，表明該方法精密度良好。取同一份混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按試驗(yàn)條件每隔1，2，4，8和24 h進(jìn)樣分析，結(jié)果表明，放在冰箱4℃保存的標(biāo)準(zhǔn)溶液在24 h內(nèi)無(wú)明顯變化。
3討論與結(jié)論
食品中的生物胺是在細(xì)菌大量繁殖后產(chǎn)生的，而細(xì)菌的大量繁殖意味著食品在不斷腐敗。因此，影響生物胺產(chǎn)生的因素與食品的腐敗有關(guān)。趙中輝等認(rèn)為不同的水產(chǎn)品在體型大小、器官結(jié)構(gòu)、生理狀態(tài)及組織成分等方面都存在著差異，這就使得食品腐敗過(guò)程中的菌相、菌類繁殖速度都有所不同。凡是體內(nèi)水分多、含氮物質(zhì)高、游離氨基酸豐富的水產(chǎn)品，都比較容易腐敗，并產(chǎn)生生物胺。Daniel M．Linares等認(rèn)為食品在加工及貯藏過(guò)程中會(huì)因細(xì)菌的氨基酸脫羧酶活動(dòng)而產(chǎn)生生物胺。有研究報(bào)道食鹽含量對(duì)食品貯藏過(guò)程中生物胺的合成也有顯著影響。Na Cl會(huì)破壞細(xì)胞膜上的氨基酸脫羧酶及抑制微生物的生長(zhǎng)繁殖，使得食品中生物胺的含量降低。劉東紅等認(rèn)為5℃低溫條件下、氣體配比為70% N2/30% CO2的氣調(diào)包裝能有效地抑制微生物繁殖，同時(shí)還能較大程度地保持蝦皮的色澤和特有風(fēng)味，達(dá)到最佳保鮮效果。蝦皮中生物胺含量和種類的變化與蝦皮制作過(guò)程中的原料選擇、干制過(guò)程中的食鹽添加量、包裝前的水分含量及貯藏方法等因素密切相關(guān)，這些因素有待進(jìn)一步研究。
試驗(yàn)以乙腈-水為流動(dòng)相，丹磺酰氯作為衍生試劑進(jìn)行柱前衍生，采用梯度洗脫的高效液相色譜法對(duì)市售蝦皮中的生物胺進(jìn)行了分析，該方法可在20 min內(nèi)完成色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、酪胺、亞腈胺及精胺7種生物胺的分離分析，該方法樣品前處理簡(jiǎn)單，精密度較高，可為測(cè)定蝦皮中的7種生物胺含量提供技術(shù)支持。
