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洪甜，晉帥，張立，李玲，梁迎春，宋燁瓊，董倩，劉陽(yáng)，徐小潔，葉棋濃

1．軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所，北京100850;

2．解放軍總醫(yī)院，北京100853；

3．總參警衛(wèi)局衛(wèi)生保健處，北京100017

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[摘要]目的：構(gòu)建攜帶Flag標(biāo)簽的人自噬相關(guān)基因4B(A TC4B)的真核表達(dá)質(zhì)粒，獲得Flag-ATG4B融合蛋白，并檢測(cè)其與LC3的相互作用。方法：以本實(shí)驗(yàn)室保存的乳腺文庫(kù)為模板，采用PCR技術(shù)擴(kuò)增獲得4TG4B序列，并將其插入p。DNA3.O-Flag載體構(gòu)建成重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞后用Western印跡檢測(cè)融合蛋白的表達(dá)，用免疫共沉淀檢測(cè)ATG4B與LC3的相互作用。結(jié)果：菌液PCR和重組質(zhì)粒的雙酶切結(jié)果及測(cè)序均表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，Western印跡表明融合蛋白在HEK293T細(xì)胞中獲得表達(dá)，免疫共沉淀結(jié)果表明表達(dá)的ATG4B能與LC3結(jié)合。結(jié)論：構(gòu)建了pcDNA3.O-Flag-ATC4B真核表達(dá)質(zhì)粒，表達(dá)的ATG4B蛋白對(duì)LC3的切割至關(guān)重要，這為進(jìn)一步研究ATG4B在自噬過(guò)程中的作用奠定了基礎(chǔ)

[關(guān)鍵詞]自噬相關(guān)基因4B;真核表達(dá)；LC3;自噬

 自噬相關(guān)基因4B(autophagy-related gene 4B，4 TG4B)編碼的ATG4B（autophagin-l）是一種組成型表達(dá)的半胱氨酸酶，特異性切割自噬相關(guān)的LC3，使自噬得以正常進(jìn)行。ATG4最早發(fā)現(xiàn)于酵母，其人同源蛋白包括ATG4A（autophagin-2）、ATG4B、ATG4C( autophagin-3)和ATG4D( autophagin-4)。相較于其他3種ATG4蛋白，ATG4B能夠更加特異高效地切割所有ATG8蛋白(LC3A、LC3B、LC3C、GAB-ARAP、GABARAPL1和GABARAPL2/GATE- 16).當(dāng)白噬被誘導(dǎo)時(shí)，細(xì)胞中的Pro- LC3( microtubule-associated proteins lA/1B light chain 3B,MAPILC3B)被ATG4B切割形成胞質(zhì)可溶性的LC3-I，自噬正常進(jìn)行，降解細(xì)胞中破損的細(xì)胞碎片以獲取能量，使細(xì)胞在惡劣環(huán)境中繼續(xù)存活。鑒于此，我們擬構(gòu)建pcDNA3.O-Flag-ATG4B真核表達(dá)質(zhì)粒，為進(jìn)一步研究ATG4B在自噬中的作用奠定基礎(chǔ)。

1  材料和方法

1.1材料

 人胚腎HEK293T細(xì)胞F}j本室傳代培養(yǎng)；質(zhì)粒pcDNA3.0為本室保存；VigoFect轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自威格拉斯生物技術(shù)有限公司；限制性內(nèi)切酶BamH I和Xho I、T4DNA連接酶、PCR相關(guān)試劑均購(gòu)自TaKa-Ra公司；質(zhì)粒提取試劑盒和膠回收試劑盒購(gòu)自Pro-mega公司；新生牛血清購(gòu)自浙江天杭生物科技有限公司；DMEM購(gòu)自Gihco公司；胰酶購(gòu)白Amersco公司；Western印跡發(fā)光檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Vigorous公司；引物由博邁德科技發(fā)展有限公司合成；aR-GFP、aR抗體、Flag-HRP和(3-actin-HRP單克隆抗體購(gòu)自Sigma公司；FIag珠子購(gòu)自Pharmacia公司。

1.2 4TG4B引物設(shè)計(jì)及PCR條件

 根據(jù)4 TC4B的CDS序列合成上游引物（5 7一CGGGATCCATGGACGCAGCTACTCTGACC-3'）和下游弓I物（5 7一CCGCTCGAGTCAAAGGGACACJGATTT CAAAGT-3-），以乳腺文庫(kù)為模板PCR擴(kuò)增目的片段，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增效果，并用膠回收試劑盒回收擴(kuò)增產(chǎn)物。擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30 s，62。C退火30 s，72?C延伸1min，30個(gè)循環(huán)；72C終延伸5 min。

1.3 pcDNA3.O-Flag-ATG4B重組質(zhì)粒的構(gòu)建

 分別用BamH I和Xho I雙酶切目的基因ATG4B和質(zhì)粒載體pcDNA3.0-Flag，目的片段直接用膠回收試劑盒回收，酶切的載體經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后膠回收大片段。用T4DNA連接酶連接具有相同粘性末端的目的基因和空載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5a，菌液PCR初步鑒定的陽(yáng)性克隆經(jīng)質(zhì)粒提取后用雙酶切進(jìn)一步鑒定目的基因是否導(dǎo)入質(zhì)粒載體。

1.4  Western印跡鑒定融合蛋白的表達(dá)

 用含雙抗和10%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)HEK293T細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)80%～90%時(shí)，用VigoFect轉(zhuǎn)染試劑將重組質(zhì)粒pcDNA3.0- Flag-ATG4B和空載體pcDNA3.O-Flag分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人胚腎HEK293T細(xì)胞（轉(zhuǎn)染方法：細(xì)胞接種于6 cm rm中，加4 VL VigoFect，補(bǔ)NaCl到200 uL，混勻，靜置5 min，再將含5pdg重組質(zhì)粒的200 uL NaCl溶液與含4 uL VigoFect的200 uL NaCl混勻，靜置15min，將混好的400 uL溶液加入6 cm皿中），4—6 h換培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染24 h后收細(xì)胞；用RIPA冰上裂解細(xì)胞30 min，加等量的2xSDS上樣緩沖緩，沸水煮15min，12 000 r/min離心2 min，取上清進(jìn)行SDS-PAGE，當(dāng)?shù)鞍譵arker分得足夠開(kāi)時(shí)即可停止電泳；電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上后，5%脫脂牛奶封閉1 h，用Flag-HRP、3-actin-HRP抗體室溫孵育l h，lxTBST洗膜5 minx3次，用化學(xué)發(fā)光法顯影。

1.5  免疫共沉淀檢測(cè)ATG4B與LC3的相互作用

 于6 cm皿中培養(yǎng)HEK293T細(xì)胞，待細(xì)胞密度達(dá)80%—90%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染（分別將pcDNA3.O-Flag和GFP- LC3共轉(zhuǎn)染，將pcDNA3.0- FIag- ATG4B和GFP-LC3共轉(zhuǎn)染），方法同上；轉(zhuǎn)染24 h后收集細(xì)胞，加人中鹽lP緩沖液500 uL /管，冰上30 min后超聲波裂解細(xì)胞，裂解畢，4℃、12 000 r/min離心10min，取30 uL上清于另- EP管中，加等量2xSDS上樣緩沖緩做Input．向每管余下上清中加入用同樣的IP緩沖液平衡好的Flag珠子，4qC結(jié)合4—6 h或過(guò)夜；結(jié)合畢，4℃、3000 r/min離心2 min，去上清，用同樣的IP緩沖液洗滌沉淀3次（4℃，3000 r/min離心2 min，間隔5 min）；洗滌畢，去上清，向沉淀中加等量2xSDS上樣緩沖緩，行Western印跡，方法同七。

2  結(jié)果

2.1  pcDNA3.0-Flag-ATG4B重組質(zhì)粒的鑒定

以本實(shí)驗(yàn)室的乳腺文庫(kù)為模板擴(kuò)增獲得約1182 bp的目的片段。將目的片段和載體質(zhì)粒雙酶切后連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，挑菌落進(jìn)行菌液PCR，可擴(kuò)增出約1200 bp的菌落，初步認(rèn)為是陽(yáng)性菌落。挑取陽(yáng)性菌落提質(zhì)粒后經(jīng)BamH I和Xho I雙酶切鑒定，以空載體為陰性對(duì)照，結(jié)果顯示酶切的重組質(zhì)粒切開(kāi)為2條帶，大小分別與空載體pcD-NA3.0- Flag和日的基因4TG4B近似，且測(cè)序證明重組質(zhì)粒pcDNA3.O-Flag-ATG4B構(gòu)建成功。見(jiàn)圖1。

2.2  Western印跡檢測(cè)ATG4B在HEK293T細(xì)胞中的表達(dá)

將構(gòu)建的pcDNA3.0- Flag- ATC4B質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，同時(shí)以轉(zhuǎn)染pcDNA3.O-Flag質(zhì)粒作為陰性對(duì)照。24 h后提取蛋白行Western印跡，檢測(cè)Flag-ATG4B重組蛋白的表、大．分別孵育以Flag-HRP和3-actin-HRP抗體。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒后，在相對(duì)分子質(zhì)量約50xl03處出現(xiàn)目的條帶Flag-ATG4B，表明重組質(zhì)粒pcDNA3.O-Flag-ATG4B在細(xì)胞中獲得表達(dá)（圖2）。

2.3  免疫共沉淀檢測(cè)ATG4B與LC3的相互作用

分別共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pcDNA3.O-Flag和GFP-LC3、pcDNA3.O-Flag-ATG4B和GFP-LC3，24 h后收集細(xì)胞，進(jìn)行免疫共沉淀。Western印跡結(jié)果顯示GFP-LC3和Flag- ATG4B均得到正確表達(dá)，F(xiàn)lag- ATG4B成功結(jié)合于Flag珠子上，與對(duì)照（轉(zhuǎn)染pcDNA3.0-Flag和GFP-LC3）相比，只有當(dāng)ATG4B存在時(shí)，LC3才被共沉淀（圖3）。

3討論

 自噬是真核細(xì)胞所特有的細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)成分被溶酶體降解過(guò)程的統(tǒng)稱，是廣泛存在于真核細(xì)胞中的生命現(xiàn)象，是生物在發(fā)育、老化過(guò)程中普遍存在的凈化自生多余或受損細(xì)胞器的共同機(jī)制。生命體借此維持蛋白質(zhì)代謝及細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，這一過(guò)程在細(xì)胞清除廢物、結(jié)構(gòu)重建、生長(zhǎng)發(fā)育中起重要作用。當(dāng)細(xì)胞自噬出現(xiàn)障礙時(shí)，會(huì)導(dǎo)致心血管疾病、腫瘤、免疫相關(guān)疾病等6-81。

 ATG4B與酵母ATG4單體有著相似的序列，是酵母ATG4的人源同源蛋白。在自噬發(fā)生過(guò)程中，ATG4B切割Pro- LC3的C端，形成成熟的LC3-I，共價(jià)結(jié)合于磷脂酰乙醇胺上，形成膜結(jié)合的LC3-Ⅱ（即PE修飾的LC3）。另外，ATG4B在自噬過(guò)程中還充當(dāng)解離酶，可以剪切無(wú)用的LC3-PEI，使LC3進(jìn)入重復(fù)利用途徑，而這對(duì)LC3-PE在正確的位置形成是必須的。ATG4B能夠調(diào)控腸道的自穩(wěn)態(tài)，以使實(shí)驗(yàn)鼠避免感染大腸炎。RNF5調(diào)控ATG4B的活性來(lái)抑制細(xì)胞的基本自噬流，使細(xì)胞容易受細(xì)菌感染。ATG4B不僅能從自噬方面影響細(xì)胞的生長(zhǎng)，還能獨(dú)立于自噬流促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生。

 本研究構(gòu)建的pcDNA3.O-Flag-ATG4B真核表達(dá)質(zhì)粒在HEK293T細(xì)胞中獲得了表達(dá)，免疫共沉淀顯示得到的Flag-ATG4B能夠與LC3結(jié)合，證明我們構(gòu)建的pcDNA3.O一Flag-ATG4B是有活性的，為研究ATG4B調(diào)控自噬奠定了基礎(chǔ)。