重組谷氨酸脫羧酶的分離純化與酶學(xué)性質(zhì)研究
相關(guān)鏈接： 中國安全網(wǎng) 中國質(zhì)量網(wǎng) 中國論文網(wǎng) 中國資訊網(wǎng)
時粲，劉昭明*，黎婭，易弋，伍時華
廣西科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院（柳州545006）
摘要利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)獲得高活力重組谷氨酸脫羧酶(GAD)并對其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行分析。結(jié)果表明，純酶比活力為9.9 U/mg;最適pH為4.6，最適溫度為40℃，重組酶有良好的熱穩(wěn)定性，在70℃處理30 min仍有80%活性，在0℃保存一個月基本不失活；輔酶PLP及金屬離子Fe2+. Ca2+. Mg2+. Cu2+對重組酶活力都有一定的促進(jìn)作用，其中PLP最適濃度為0.005mol/L;吐溫20作為非離子表面活性劑對重組GAD活力有促進(jìn)作用，而陰離子表面活性
劑SDs對其活力有明顯抑制作用；有機(jī)溶劑異戊醇對其活力有促進(jìn)作用。重組GAD的Km=23.33 mm01，V max=1.133,μm01／(min. L)。
關(guān)鍵詞 重組酶；谷氨酸脫羧酶；酶學(xué)性質(zhì)；y-氨基丁酸
谷氨酸脫羧酶( GAD，EC 4.1.1.15)是廣泛存在 于微生物、植物以及動物細(xì)胞中的一種高度專一性的磷酸毗哆醛類酶，通過催化不可逆a-脫羧反應(yīng)使L~谷氨酸（鈉）特異性地轉(zhuǎn)化為y-氨基丁酸( GABA)，y-氨基丁酸( y-Aminnohutyric acid，GABA)是一種非蛋白氨基酸，作為哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，在機(jī)體調(diào)節(jié)方面有諸多功能，如調(diào)節(jié)血壓與心率、營養(yǎng)神經(jīng)、治療癲癇、輔助治療哮喘、活化CA腎功能、促進(jìn)生長激素分泌以及抗衰老等。隨著GABA工業(yè)化應(yīng)用研究的不斷深入，具有安全性高、反應(yīng)條件溫和以及生產(chǎn)成本低等諸多特性的微生物合GA成為食品與制藥行業(yè)新的發(fā)展趨勢。已報道的GABA生產(chǎn)菌株主要有大腸桿菌（Escherichia coli、紅曲霉（Monascus）、釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）和乳酸菌（Lactobacillus）等。其中，楊帆等利用大腸桿菌作為生產(chǎn)菌株，全細(xì)胞轉(zhuǎn)化法合成GABA,轉(zhuǎn)化結(jié)束后，轉(zhuǎn)化液中GABA的質(zhì)量濃度高達(dá)60 g/L; Su等以紅曲霉為生產(chǎn)菌株，采用固態(tài)發(fā)酵法產(chǎn)GABA，測得GABA產(chǎn)量達(dá)5 004 l-L9/9；Komatsuzaki等從傳統(tǒng)發(fā)酵食物中篩選獲得了一株乳酸菌（Lactobacillus paracasei NFRI 7415），經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得發(fā)酵液中GABA質(zhì)量濃度達(dá)33.1 g/L；但是，微生物體內(nèi)GAD含量少，分離提純損失較多，所以發(fā)酵法制備GABA在工業(yè)化生產(chǎn)中還有很大的弊端。因而，借助基因工程手段構(gòu)建高拷貝重組質(zhì)粒，高效表達(dá)并獲得高活性的GAD可以大大提高GABA的生產(chǎn)效率。
谷氨酸脫羧酶基因（gadB）來源于菌株LactobacillusplantaumQL-14，構(gòu)建大腸桿菌表達(dá)菌株Escherichiacoli BL21-pGEX-4T-gadB，原核表達(dá)并純化獲得高活力GAD。通過對pH、溫度等酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，GABA定該酶作用的合適條件從而達(dá)到體外酶法制備GABA的目的。
1 材料與方法
1.1材料
1.1.1菌株
工程菌Esche，ichia coli BL21-Pgex-4T-gadB，廣西科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院發(fā)酵工程研究室保藏。
1.1.2試劑
L-谷氨酸鈉，市售；磷酸吡哆醛( PLP，BR)：美國AMRESCO公司；異丙基-β-D-巰基半乳糖苷( IPTG)：寶生物工程（大連）有限公司；氨芐青霉素鈉( AMP)：SolarBio公司；y-氨基丁酸(含量≥99%，AR)：美國sigma公司；GST瓊脂糖凝膠FF：北京韋氏博慧色譜科技有限公司。
1.1.3儀器與設(shè)備
MIKR0 220R 2205型低溫冷凍離心機(jī)：德國HET- TICH; UV-1100型紫外可見分光光度計：上海美譜達(dá)儀器有限公司；AB104-N型電子分析天平：美國雙杰 兄弟有限公司；HWY-2112全溫度恒溫調(diào)速搖床柜：上海智城分析公司；恒溫水浴鍋：北京東方精瑞科技發(fā)展有限公司；JY600CDNA電泳儀：北京六一儀器廠。
1.2方法
1.2.1工程菌的活化及谷氨酸脫羧酶的獲得
取保存的工程菌活化于10 m L LB液體培養(yǎng)基（含100μg /m L AMP）37℃、12 000 r/min搖床過夜培養(yǎng)，取新鮮培養(yǎng)的重組菌菌液8.0 m L(含100μg/m LAMP)接種于800 m L LB液體培養(yǎng)基(含100μg/m LAMP)，37℃、12 000 r/min搖床培養(yǎng)至OD600=0.4～0.6時加入IPTG至終濃度1.0 m mol/L在16 ℃下過夜誘導(dǎo)。將誘導(dǎo)表達(dá)的菌液800 m L于6 000 r/min、4℃離心15min，收集菌體，用20 m L PBS緩沖液(pH 7.4)懸浮菌體，超聲破碎細(xì)胞，然后經(jīng)0.45μm濾膜過濾后上柱，用CST瓊脂糖凝膠柱對重組蛋白進(jìn)行純化得到目的蛋白GAD。純化后的蛋白經(jīng)10%的SDS-PAGE蛋白電泳進(jìn)行驗證。以BSA（牛血清蛋白）為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，采用Bradford法測定其濃度。
1.2.2谷氨酸脫羧酶活力的測定
采用Berthelot法。配制底物溶液Macllvaine緩沖體系（pH 4.8，含0.02 mol/L底物L(fēng)-谷氨酸鈉，0.01m mol/L輔酶PLP），取400 μL底物溶液和200μL酶液在37 ℃反應(yīng)30 min，煮沸終止反應(yīng)；再加入1.0 m L體積分?jǐn)?shù)6%苯酚和1.0 m L次氯酸鈉溶液，充分振蕩后，沸水浴中反應(yīng)10 min，迅速在冰浴中冷卻顯色20min，待出現(xiàn)藍(lán)綠色后加入體積分?jǐn)?shù)60%乙醇溶液2.0m L，最后在643.5 nm處測定吸光度。
1.2.3谷氨酸脫羧酶酶學(xué)性質(zhì)
1.2.3.1 最適pH的確定及pH穩(wěn)定性
配制pH 3.6～6.0的底物反應(yīng)緩沖液，37℃下將酶液分別與不同pH的反應(yīng)液混合，測定GAD最適反應(yīng)pH。再將一定量的酶液加入到以上不同pH的反應(yīng)緩沖液中，37℃下分別保溫2h，測定剩余酶活，考察GAD在不同pH條件下的穩(wěn)定性。
1.2.3.2最適反應(yīng)溫度及溫度穩(wěn)定性
采用pH 4.8的反應(yīng)緩沖液，分別在20℃，25℃,30℃,35℃, 37 ℃, 40℃, 45 ℃. 50 ℃, 55℃,60℃，65℃和70℃下測定酶活，研究GAD的最適溫度。將酶液置于以上不同溫度下保溫60，90, 120,150和180 min，測定剩余酶活，考察GAD在不同溫度下的穩(wěn)定性。
將酶液儲存于0 ℃保溫一個月，每隔一周取出于最適條件下測定剩余酶活，考察GAD的低溫條件下的穩(wěn)定性。
1.2.3.3輔酶濃度對酶活的影響
采用37℃，pH 4.8的反應(yīng)緩沖液，分別在輔酶濃度0, 0.005, 0.01, 0.015, 0.02, 0.03, 0.04和0.05m mol/L條件下測定酶活，研究輔酶濃度對酶活力的影響。
1.2.3.4不同金屬離子及EDTA對酶活的影響
在pH 4.8的反應(yīng)液中分別加入終濃度為1m mol/L 的Ca2+,Mg2+, K+, Fe2+,Pb2+,Cu2+,Mn2+, Zn2+,Co2+,Al3+，Li+以及EDTA，37℃下測定GAD酶活，以不加金屬離子的反應(yīng)液作為對照組，研究不同金屬離子及EDTA對其酶促反應(yīng)的影響。
1.2.3.5表面活性劑對酶活力的影響
在pH 4.8的反應(yīng)液中分別加入1%的表面活性劑吐溫20、吐溫80、SDS和聚乙烯醇，37 ℃下測定GAD酶活，以不加表面活性劑的反應(yīng)液作對照組，研究不同的表面活性劑對酶活力的影響。
1.2.3.6有機(jī)溶劑對酶活力的影響
在pH 4.8的反應(yīng)液中分別加入1%的有機(jī)溶劑甲醇、乙醇、乙醚、丙酮、異戊醇、丙三醇和正丁醇，37℃下測定GAD酶活，以不加有機(jī)溶劑的反應(yīng)液作對照組，研究不同的表面活性劑對酶活力的影響。
1.2.3.7米氏常數(shù)的確定
配制不同濃度的L-谷氨酸鈉底物溶液分別與酶液在37 0c下反應(yīng)30 min，同時將一定濃度的底物緩沖液與酶液在37℃反應(yīng)不同時間并測定酶活，采用雙倒數(shù)作圖法確定GAD的K及V max值。
2結(jié)果與分析
2.1 重組酶的純化及活力測定
經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的菌液經(jīng)超聲波破碎細(xì)胞，上清液即為粗酶液。用GST瓊脂糖凝膠柱純化目的蛋白并切除GST標(biāo)簽蛋白。純化后的GAD經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果見圖1，可看出經(jīng)過純化后得到相對單一的條帶，表面已經(jīng)得到較純的GAD酶。純化后酶液經(jīng)測定蛋白含量為0.626 mg/m L。經(jīng)測定純化后的GAD比酶活達(dá)到9.9 U/mg。
2.2最適pH的確定及pH穩(wěn)定性
GAD在pH 3.6～6.0范圍內(nèi)反應(yīng)時測定其酶活，由圖2可見，最適pH為4.6，在pH 4.2～5.0范圍內(nèi)酶活都在50%以上；pH高于5.2時酶活力下降較為顯著。pH穩(wěn)定性方面，將GAD在pH 3.6～6.0不同pH條件下處理2h后測定酶活性，CAD在pH 4.0～4.8范圍內(nèi)保溫2h后均能保持80%以上的酶活力；pH大于5.0，酶活降低較為明顯，說明該GAD在酸性環(huán)境下相對穩(wěn)定，具有較高的酸依賴性。
2.3最適反應(yīng)溫度及溫度穩(wěn)定性
在20℃～70℃范圍內(nèi)進(jìn)行GAD酶促反應(yīng)，測得的酶活結(jié)果見圖3。由圖3 (A)可知該GAD在20℃～40℃范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，酶活上升趨勢明顯，40℃時酶活性達(dá)到最高；在40℃～70℃隨著溫度升高，酶活則呈下降趨勢，下降幅度不大，并且在70℃還有80%活性。熱穩(wěn)定性試驗結(jié)果如圖3(B)所示，GAD在20℃～40℃較穩(wěn)定，水浴保溫2h后相對酶活仍在
85%以上，說明該酶在此溫度范圍內(nèi)具有較高的穩(wěn)定性，隨著溫度的升高，酶穩(wěn)定性逐漸下降，到達(dá)55℃時水浴保溫1h，酶活急速下降。
在低溫穩(wěn)定性方面從圖4可以知道，該酶在0℃時有良好的穩(wěn)定性，并且將酶置于0℃環(huán)境下，1～5周酶活基本上沒有喪失。
2.4輔酶濃度對酶活的影響
GAD是磷酸吡哆醛類酶，GAD在生物體內(nèi)以PLP為輔酶進(jìn)行催化反應(yīng)。試驗研究輔酶PLP的濃度對重組GAD的活力的影響，圖5可以看出，低濃度的輔酶PLP對重組GAD活力有一定促進(jìn)作用，隨著輔酶濃度的增加重組GAD的活力提高不明顯，而脫輔基GAD仍有一定的活力。
2.5不同金屬離子及EDTA對酶活的影響
金屬離子與輔酶一樣可以影響生物體內(nèi)不同酶的催化作用，經(jīng)常作為促進(jìn)或者抑制酶反應(yīng)的輔助因子。因此在酶促反應(yīng)中經(jīng)常添加某些金屬離子來改善酶促反應(yīng)的進(jìn)行。在重組GAD酶促反應(yīng)中添加各種金屬離子以及EDTA來考察不同金屬離子對重組CAD酶促反應(yīng)的影響，見圖6�？梢钥闯鯶n2+、Li+.Pb2+和EDTA均對重組GAD的活力有較大的抑制作用，Mri2+、Al3+和CO2+等對活性影響不明顯，F(xiàn)e2+、Ca2+.Mg2+和Cu2+對該酶有較強(qiáng)的激活作用。
2.6表面活性劑對酶活力的影響
表面活性作為一種能夠影響酶溶液表面張力的物質(zhì)往往用于改善酶促反應(yīng)。試驗中，以不加表面活性劑的對照組，活力最高的設(shè)為100%，以加入1%的不同的表面活性劑吐溫20、吐溫80、SDS和聚乙烯醇為試驗組，探究其對重組GAD活力的影響。如圖7所示，吐溫20和吐溫80對GAD活力均有不同程度的促進(jìn)作用，分別提高55%和42%符合非離子表面活性劑作為乳化劑促進(jìn)酶促反應(yīng)的一般規(guī)律，而SDS和聚乙烯醇對GAD活力有不同程度的抑制作用，其中SDS對重組GAD抑制作用最大。
2.7有機(jī)溶劑對酶活力的影響
有機(jī)溶劑不僅可以改變酶催化反應(yīng)的平衡點使其在水溶液中不能或者很難發(fā)生的反應(yīng)向著期望的方向進(jìn)行，還可以調(diào)節(jié)包括區(qū)域?qū)Ｒ恍院蛯τ丑w專一性在內(nèi)的底物專一性，從而使酶的催化調(diào)節(jié)成為可能。為此，試驗通過在酶反應(yīng)中加入一定量的不同有機(jī)溶劑，以不加有機(jī)溶劑的對照組，設(shè)酶活力最高的為100%，研究不同有機(jī)溶劑對GAD酶活力的影響。如
圖8可以看出甲醇、乙醇、乙醚、丙酮、丙三醇和正丁醇對GAD活力均有抑制作用，異戊醇對其活力有促進(jìn)作用。說明大部分有機(jī)溶劑對水相中的酶活力作用不大，但是部分有機(jī)溶劑可以成為酶活力調(diào)節(jié)的促進(jìn)劑。
2.8米氏常數(shù)的確定
通過測定不同底物濃度下的酶活力，按照米氏方程，得出1/[S]與1/V的關(guān)系，并用Lineweave，-burk作圖法，求出重組GAD的米氏常數(shù)，見圖9，可得Km=23.33 m mol/L, V max=1.133μ mol/( min. L)。
3結(jié)論與討論
利用基因工程手段獲取谷氨酸脫羧酶( GAD) -直是近幾年的研究熱點。試驗中的GAD最適反應(yīng)pH為4.6，并且在最適pH 4.0～4.8有較高活性，與已報道的微生物來源的GAD反應(yīng)最適pH在4.0～6.0之間基本一致。不同來源GAD溫度的穩(wěn)定性不盡相同，孿云等分離的片球菌（Pediococcus）中GAD在60℃時相對酶活力僅35.30%, Fan E等克隆的短乳桿菌（Lactobacillus brevis CGMCC 1306）在70℃相對活性僅有10%，而試驗中重組GAD在70 ℃反應(yīng)條件下處理30 min仍有80%，50℃處理2 h仍有50%以上活性體現(xiàn)出較高的溫度耐受性。0 ℃熱穩(wěn)定性分析結(jié)果也從側(cè)面反映出該GAD良好的熱穩(wěn)定性。通過測定一定溫度下酶反應(yīng)的動力學(xué)常數(shù)并符合米氏方程得出重組GAD的米氏常數(shù)Km=23.33 m mol/L，Vmax=1.133μmol/( min．L)。
由于GAD是磷酸吡哆醛(PLP)類酶，輔基PLP理論上對酶的活力及酶的活性會有所影響，試驗發(fā)現(xiàn)輔酶PLP的最適添加量為0.005 m mol/L，GAD活力提高14%，與報道的PLP對脫輔基GAD活性影響不大結(jié)果基本一致。在影響酶活性的另一個方面金屬離子中，發(fā)現(xiàn)Mg2+對該酶有較強(qiáng)的激活作用與報道較為一致，而Ca2+對GAD的促進(jìn)作用類似于植物中Ca2+通過形成鈣調(diào)蛋白黏合區(qū)域( Ca M)影響GAD的作用原理。但是Fe2+和Cu2+對該酶也有激活作用，與報道中Fe2+、Cu2+對微生物體內(nèi)GAD活性有較強(qiáng)抑制作用的結(jié)論截然相反，而得到了與試驗相同的結(jié)論Cu2+對重組GAD活性有促進(jìn)作用，說明重組GAD與天然GAD特性有較大差別。Zn2+、Li+以及EDTA對GAD酶活性有部分抑制作用。
非離子表面活性劑如吐溫（聚山梨酯）等對酶活影響較小，甚至有激活作用；陰離子表面活性劑對酶活力影響較大，主要起抑制作用。試驗通過研究四種表面活性劑對重組GAD活性的影響發(fā)現(xiàn)，吐溫20對酶活力促進(jìn)作用最大這是因為吐溫作為表面活性劑在反應(yīng)體系中起乳化作用在一定濃度下是底物與酶充分接觸有利用酶促反應(yīng)，而SDS對其較強(qiáng)抑制作用，
則可以認(rèn)為是SDS作為離子型表面活性劑通過靜電作用使酶的構(gòu)象發(fā)生變化從而導(dǎo)致酶活力下降。有機(jī)溶劑通過奪去蛋白表面水分子造成酶分子內(nèi)部疏水基團(tuán)暴露從而改變反應(yīng)過程中的界面效應(yīng)，大部分有機(jī)溶劑對GAD酶活力有抑制作用，而異戊醇對GAD促進(jìn)作用也是由于異戊醇的乳化作用。
通過對重組GAD特性及體外轉(zhuǎn)化GABA條件進(jìn)行探究為GABA的工業(yè)化生產(chǎn)提供了必要的參考依據(jù)。
