運用重疊延伸PCR技術構建SGK3激酶PX結構域突變體
呂文杰，王洪濤，黃芳，王健，王芃，洪鎏，周建光，潘耀振，李山虎
1．貴州醫(yī)科大學，貴州貴陽550001；2．軍事醫(yī)學科學院生物工程研究所，北京100850
——
[摘要]目的：構建SCK3激酶PX結構域突變體載體，觀察其在人腎胚細胞293T中的表達與定位。方法：利用重疊延伸PCR原則設計引物，合成具有點突變的SGK3突變體，將其連接到pEGFP載體上，測序驗證；將所獲突變載體瞬時轉染人腎胚細胞293T，利用熒光倒置顯微鏡檢驗突變體在細胞中的表達及功能實現(xiàn)。結果：測序結果表明合成了具有點突變的SGK3序列；熒光倒置顯微鏡下SGK3突變體相較野生型SGK3在293T細胞內的不均勻分布表明轉染成功，突變體載體在人腎胚細胞293T中獲得表達且有所定位。結論：通過改變PX結構域序列上第90位氨基酸可以使SGK3激酶失去定位的功能，從而為研究SGK3在細胞中的功能提供基礎。
[關鍵詞]SGK3激酶；重疊延伸PCR；PX結構域
SGK3是屬于AGC蛋白家族的激酶。SGK家族有3個同分異構體SGKI、SGK2和SGK3，它們與AKT家族分子的催化域擁有近55%的相同序列。SGK3受轉錄及轉錄后磷酸化修飾，在PI3K下游作為連接生長因子、胰島素、營養(yǎng)物等與細胞生長、增殖、代謝、生存的一條重要途徑。近年來隨著研究的進展，SGK3在乳腺癌、前列腺癌、肝癌細胞中的重要作用逐漸受到重視。
已知SGK3的分子結構包括3個主要的功能區(qū)域，即位于N端的PX( Phox)結構域、中間的催化結構域和C端的疏水域。PX結構域對磷脂酰肌醇( PIP)特別是PI(3)P有很強的親和力，可以使含有這種結構的分子特別是信號分子定位在富含這類分子的細胞內膜結構的表面，特別是初級內體(early en-dosome)上，受上游刺激后在細胞內傳遞信號。我們擬構建點突變PX域的SGK3質粒，再使其轉染293T細胞后表達，并用免疫熒光顯微鏡觀察其在細胞中的定位，為SGK3后續(xù)的功能研究奠定基礎。
1 材料與方法
1.1材料
人腎胚細胞293T、pEGFP載體為本實驗室保存；T4 DNA連接酶、限制性內切酶BamH I與Xho I購自TaKaRa公司；質粒提取試劑盒及Vigofect轉染試劑購自Vigorous公司；ULybrene購自Santa Cruz公司；嘌呤霉素購白Sigma公司；山羊抗小鼠、山羊抗兔、兔抗山羊抗體購自中杉金橋公司。
1.2引物合成
參考GenBank中的SGK3序列，根據文獻設計SGK3引物及PX結構域突變位點（具體見結果部分及其圖示），由北京天一輝遠公司合成。見表1。
1.3單重PCR反應
以實驗室現(xiàn)有野生型SGK3質粒為模板進行PCR擴增，PCR產物為重疊延伸PCR所需的A、B片段。A片段PCR反應體系：SGK3模板0.51 uL，引物1 1uL，突變引物B 1uL，dNTP l uL L，iox緩沖液2uL，Pfu高保真酶0.5uL，ddH：0 14 111，共20 uL。B片段PCR反應體系：SGK3模板0.5 uL，引物2 1uL，突變引物A 1uL，dNTP l uL，10X緩沖液2uL，Pfu高保真酶0.5 uL，ddH：0 14 uL，共20 uL。PCR反應條件：預熱94。C3 min，解鏈95℃30 s．退火55℃30 s，延伸70cCl min，30次循環(huán)。反應結束后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測2組擴增片段，分別切下含有目的片段的膠條，用膠回收試劑盒回收，獲得用于重疊延伸PCR的DNA片段。
1.4重疊延伸PCR反應
分別取上述擴增的A、B片段進行重疊延伸PCR反應。反應體系：模板為A、B片段各1uL，引物1（A片段）1 uL，引物2（B片段）1UL，dNTP l uL，10X緩沖液2uL，Pfu高保真酶0.5uL，ddH：0 13.5uL，共20I uL。PCR反應條件：預熱94qC3 min，解鏈95℃30 s，退火55℃30 s，延伸70。C2 min，32次循環(huán)。所得PCR產物用1.5%瓊脂糖凝膠檢測回收。
1.5 構建pEGFP-SGK3突變體
將PCR回收產物與pEGFP載體分別用BamHI /Xho I雙酶切過夜（pEGFP載體500 Vg或PCR回收產物30 uL，10×緩沖液1.75 UL，BamH 1 0.3uL，Xh0 1 0.3 uL，lOOxBSA 0.35 uL，加水至35uL），之后用1.5%瓊脂糖凝膠鑒定并回收酶切產物，用T4 DNA連接酶連接過夜（酶切產物15 uL，連接酶緩沖液2 uL．載體1uL，連接酶0.3uL，水1.7uL)，測序。
1.6瞬時轉染和細胞培養(yǎng)
從液氮儲罐中取出人腎胚細胞293T，快速復溫，離心去除凍存液，用含10% FCS的DMEM在37。C、5% CO2條件下培養(yǎng)，2—3 d傳代，待細胞生長至60%可開始瞬時轉染，轉染前須更換新鮮的細胞培養(yǎng)液。在超凈臺下取質粒pEGFP-SGK3-R90A及pEGFP-SGK3- WT（作為對照）各1ug，分別加入70uL DMEM;再取3份轉染試劑PEI各1uL，分別加入70uL DMEM中；輕輕混勻各管中試劑，靜置5 min；再分別將質粒溶液緩慢加入轉染試劑PEI溶液中，輕輕混勻后靜置20 min；取質粒、轉染試劑混勻溶液，緩慢滴人細胞培養(yǎng)皿中，搖勻后放入細胞培養(yǎng)箱中，12 h后更換新鮮培養(yǎng)液。
2結果
2.1 突變體的設計
圖1為SGK3的結構簡化圖。我們在NCBI的GenBank中查找出SGK3的mRNA序列，找到其PX結構域中第90位氨基酸的3個堿基對，將其中精氨酸(R)的堿基序列AGA替換為丙氨酸(A)的GCC，再按照引物設計原則擴選選取上下游方向各約10bp的堿基對作為突變引物。按照PCR原理，分別以SGK3引物和突變引物兩兩配對合成帶有可配對的重疊序列的SGK3突變體A、B片段，再用PCR技術將帶重疊序列的A、B片段構造成一個完整的SGK3突變體（圖2）。
2.2 突變基因的克隆與鑒定
PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳鑒定結果如圖3，單重PCR擴增出R90A的上游序列約300 bp、下游序列約1000 bp，重疊延伸PCR反應后SGK3-R90A約1500 bp，結果與預期大小相同。重疊延伸PCR產物同對照的野生型SGK3片段經瓊脂糖凝膠電泳對比鑒定大小均相同（圖4）。將構建的質粒送北京天一輝遠公司測序，結果用Chromosome軟件對比分析，如圖5，表明成功構建了SGK3片段中R90A點突變位點。
2.3 SGK3激酶PX結構域突變體的細胞定位檢測
將轉染細胞培養(yǎng)48 h后在熒光倒置顯微鏡下觀察細胞內SGK3PX結構域突變體及對照pEGFP-SGK3的分布，如圖6，可以發(fā)現(xiàn)轉染pEGFP-SGK3-R90A的細胞中綠色熒光物質分布均勻，而pEGFP-SGK3細胞中綠色熒光在細胞內局部增強，表明突變后的SGK3無法在細胞內定位，而野生型的SGK3分子可以定位聚集在胞內特定部位。
3討論
基因突變技術是生物學研究中重要的技術之一，通過有目的地改變目標DNA序列的堿基，為研究基因的表達，特別是蛋白質的結構與功能的關系提供基礎。重疊延伸PCR技術由Horton在1989年建立，是利用PCR技術的原理和特點，采用具有互補末端的引物擴增目的片段，使PCR產物形成具有互補重疊鏈的DNA片段，在第二次擴增反應中通過DNA鏈重疊部分的延伸，將2段不同的擴增片段拼接起來。與傳統(tǒng)方法相比，重疊延伸PCR定點誘變幾乎可以在DNA模板上的任何位點引入突變，過程快捷、簡便、成本低廉，無須借助其他試劑或技術。目前重疊延伸PCR定點誘變技術已成為DNA靶片段產生突變的常用方法。
PX結構域首先發(fā)現(xiàn)于NADPH氧化酶復合物的p40”““和p47”“…亞基中。PX結構域通常包含100～140個氨基酸殘基，有著特定的保守的空間結構。它存在于100多種真核細胞蛋白中，參與膜運輸生理過程。細胞膜和胞內細胞器膜中都有特異性的磷脂，磷脂酰肌醇是其中之一，參與多種生理過程。PIP有7種，分別為PI(3)P、Pl,，，P、Pls)P、PI13.41P2、PIc351P.、PI14.11P2和PI(l;.4.f，P3。其中，Plc3)P主要分布于初級內體，PI,3.5，P：主要分布于次級內體(late endosome)和溶酶體，Pl．。，P、PI4.51P：和PIii，，B主要分布于細胞膜l…。Tessier等用蛋白脂質覆蓋試驗證實SGK3的PX結構域對PI．，IP具有高度親和性，可以與其結合，同時也能少量地與Pl c。，P、PIisiP、PI3.4)P.和PI175)P.結合l6 1，這說明SGK3可以通過它的PX結構域主要結合在胞內的初級內體上。實驗中我們針對PX域中第90位氨基酸，這是一個處于磷酸肌醇頭部的與磷脂的潛在結合位點，利用重疊延伸PCR技術使用丙氨酸將其精氨酸替換，SGK3分子中的PX結構域就無法行使其結合磷脂酰肌醇的功能，從而使得SGK3在細胞中無法定位（在初級內體中）。SGK3 PX結構域點突變的構建與表達，為進一步探索SGK3的分子功能、解釋SGK3的分子作用機制提供了有力證據。
下一篇:返回列表
