腺病毒55型在A549細(xì)胞中的增殖動力學(xué)特征
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張綺玲，李慶軍，王鑫，曲新艷，楊全，楊靜
1．廣東藥學(xué)院中藥學(xué)院，廣東廣州，510006;
2．軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京100850;
3．河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，鄭州河南450008
[摘要]目的：利用噬斑法研究人呼吸道腺病毒55型( HAdV-B55)在A549細(xì)胞中的增殖動力學(xué)特征。方法：以正交法得出HAdV-B55的最佳噬斑條件；HAdV-B55以感染復(fù)數(shù)(MOI)為10感染A549細(xì)胞，噬斑法測定接種后3、6、9、12、15、18、21、24、36、48、60和72 h培養(yǎng)液上清中的病毒滴度，繪制log：（病毒滴度）一時間圖，分析HAdV-B55在A549細(xì)胞中的增殖動力學(xué)特征。結(jié)果：終濃度含0.5%瓊脂糖、2%胎牛血清和1640(2x)細(xì)胞培養(yǎng)液為HAdV-B55噬斑形成的最佳條件；MOI=10時，HAdV-B55感染A549細(xì)胞后12—15 h培養(yǎng)液中開始出現(xiàn)病毒，接種后15—36 h培養(yǎng)液中病毒量呈指數(shù)大量增加，接種后48～60 h病毒量出現(xiàn)小幅上升，接種后60 h細(xì)胞完全病變，病毒量增加達(dá)到平臺期，最終病毒量增加約225 000倍。結(jié)論：A549細(xì)胞能有效地?cái)U(kuò)增HAdV-B55，其增殖周期為12—15 h；為研究HAdV-B55的感染致病機(jī)制，以及指導(dǎo)后期抗HAdV-B55的藥物研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。
[關(guān)鍵詞]腺病毒55型；噬斑；增殖動力學(xué)；A549細(xì)胞
腺病毒( adenovirus，AdV)是一種沒有包膜的直徑為70—90 nm的雙鏈DNA病毒。它對人類呼吸道、胃腸道、尿道和膀胱、眼、肝臟等均可發(fā)生感染，可引起嬰兒和兒童急性發(fā)熱性咽喉炎、胃腸炎，兒童急性出血性膀胱炎、咽結(jié)膜熱、急性呼吸系統(tǒng)疾病、角膜炎、肺炎、女性宮頸炎和男性尿道炎等。腺病毒約1/3的已知血清型通常與人類疾病相關(guān)，人腺病毒( HAdV)分為A、B（包括Bl、B2亞組）、C、D、E、F組，呼吸道疾病主要由Bl、C、E組腺病毒引起。自2011年以來，我國不同地區(qū)先后多次暴發(fā)大面積經(jīng)呼吸道傳播的傳染病疫情，經(jīng)檢測，病原分別為腺病毒B組7、14、55型。新型HAdV- B55實(shí)際上是HAdV-Bll和14的Hexon基因重組突變體，致病能力高于HAdV-Bll和14，是目前引起急性呼吸系統(tǒng)疾病(acute respiratory disease，ARD)的重要因素，感染急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory diseas-es syndrome,ARDS)的病死率最高能達(dá)到80%151。在我國，2009年首次出現(xiàn)HAdV-B55疫情的報(bào)告，247名師生及市民發(fā)病，1名學(xué)生死亡；近年來，HAdV-B55在成年人特別是學(xué)校和軍隊(duì)特殊人群中引起日趨嚴(yán)重的急性呼吸道傳染病流行。近年HAdV-B55引起的成年急性呼吸道傳染病流行可能遠(yuǎn)高于實(shí)際報(bào)道病例，其潛在的威脅不容小覷。
目前，臨床上并無特效抗呼吸道腺病毒的藥物，多數(shù)治療是使用廣譜抗病毒藥物如西多福韋、利巴韋林、干擾素等，這些藥物僅在早期應(yīng)用具有縮短病程、減輕癥狀的作用。中藥大青葉、穿心蓮、板藍(lán)根、苦碟子，以及古方類如蒿芩清膽湯、三仁湯等在中醫(yī)典籍中有許多對癥治療呼吸道病毒感染的記載，但對腺病毒的抑制活性并不清楚。主要原因在于仍然缺乏用于藥物篩選和評價(jià)的腺病毒感染模型及檢測方法。腺病毒滴度測定有殼蛋白免疫法、熒光定量PCR法、D260n。法、細(xì)胞病變CPE法、噬斑法等。前4種方法已有文獻(xiàn)報(bào)道，但依1日缺乏噬斑方面的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。本研究擬建立檢測HAdV-B55滴度的噬斑法，通過對比討論培養(yǎng)基、羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、胎牛血清(FBS)、甲基纖維素(MC)、瓊脂糖濃度對HAdV-B55噬斑形成的影響，得到最適營養(yǎng)覆蓋物配比進(jìn)行噬斑實(shí)驗(yàn)，在此基礎(chǔ)上完善HAdV-B55在A549細(xì)胞中的增殖動力學(xué)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，探討HAdV-B55型在A549細(xì)胞中的增殖動力學(xué)特征，從而為研究HAdV-B55的感染致病機(jī)制及抗腺病毒藥物研發(fā)奠定基礎(chǔ)。
1材料與方法
1.1材料
A549細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存，用含loo/o FBS和1%雙抗的1640培養(yǎng)液培養(yǎng)（37C、5% C02貼壁培養(yǎng)，2d傳代一次）；HAdV-B55為本實(shí)驗(yàn)室保存，貯存于-70。C冰箱中；1640培養(yǎng)液、0.25 %胰酶-EDTA、1640干粉均購自GIBCO公司；雙抗（青霉素lXl04 U／mL，鏈霉素1X104ILg/mL）、FBS為Hyclone公司產(chǎn)品；HEPES緩沖液(l mol/L)為邁晨生物科技公司產(chǎn)品；瓊脂糖為北京希凱創(chuàng)新科技有限公司產(chǎn)品；甲基纖維素為Sigma公司產(chǎn)品。
CO2細(xì)胞培養(yǎng)孵箱、生物安全柜、-70℃冰箱、超凈工作臺均為Thermo Forma公司產(chǎn)品；倒置顯微鏡為Olympus公司產(chǎn)品；制冰機(jī)為SANYO公司產(chǎn)品；Mili-Q超純水系統(tǒng)為Millipore公司產(chǎn)品。
1.2營養(yǎng)覆蓋物的配制
MC覆蓋物：2x培養(yǎng)液與MC溶液按1:1混合（其余成分如FBS、HEPES和雙抗等按照需要量預(yù)先溶解到2x培養(yǎng)液中），用力搖勻，靜置數(shù)小時后分裝，4℃備用。
瓊脂糖覆蓋物：同上述方法現(xiàn)配現(xiàn)用。
2×培養(yǎng)液：1640干粉9.6 g用500 mL注射用水溶解，加入NaHCO2粉末2g溶解完全，再用1mol/L的NaOH和1 mol/L的HCI溶液調(diào)pH值為7.0—7.2，用0.2um濾器過濾，4℃備用。
2%瓊脂糖（或MC）溶液：4 g瓊脂糖（或MC）粉末用200 mL熱Mili-Q超純水(75～lOOqC)分散后，室溫持續(xù)攪拌至液體呈透明的均勻黏稠物，高壓滅菌，4℃備用。
1.3 噬斑實(shí)驗(yàn)
A549細(xì)胞以4x105／孔接種到12孔板，次日待細(xì)胞長至致密單層，用病毒稀釋液以400 p4L/孔感染A549細(xì)胞，于37C、50/o CO2條件下孵育1 h，吸棄病毒稀釋液，用PBS洗2次，加入瓊脂糖（或MC）覆蓋物，37。C、5% CO2孵育，每日觀察噬斑情況，待噬斑明顯且不再增多時（第Sd），用4%甲醛溶液同定，用1%結(jié)晶紫溶液染色，計(jì)數(shù)。噬斑形成單位(PFU/mL)=(噬斑數(shù)×病毒稀釋度×1 mL)/400 VL。
1.4 HAdV-B55在A549細(xì)胞中的增殖動力學(xué)
病毒以MOI=10接種A549細(xì)胞，37C、5% CO2孵育th，吸棄病毒液，PBS洗2次，加入含20/0 FBS的維持液于37C、50/o CO2孵育，分別于接種后3、6、9、12、15、18、21、24、36、48、60、72 h收集細(xì)胞培養(yǎng)液，噬斑法分別計(jì)算病毒滴度。
1.5 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理
實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Graphpad Prism 5軟件包處理，數(shù)值變量采用x+s進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述，以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。不同時間點(diǎn)培養(yǎng)液中病毒滴度用噬斑形成單位( PFU/mL)表示，病毒滴度取以2為底的對數(shù)后與對應(yīng)時間做圖進(jìn)行分析。
2結(jié)果
2.1瓊脂糖（或MC溶液）濃度及FBS對噬斑形成的影響
2x1640分別與不同濃度的瓊脂糖（或MC溶液）對半混合均勻，并加入HEPES緩沖液、1010雙抗，配制成營養(yǎng)覆蓋物。HAdV-B55分別稀釋至1／104和1／105后感染12孔板中的A549細(xì)胞單層，分別用終濃度含0.5 %、0.7%、1%的瓊脂糖（或lo/o MC溶液）與2%、5% FBS正交配比得到的營養(yǎng)覆蓋物進(jìn)行噬斑實(shí)驗(yàn)，每組2個復(fù)孔。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HAdV-B55稀釋至1／104時，細(xì)胞發(fā)生大面積病變，無噬斑出現(xiàn)。病毒稀釋至1／105時，含1%、0.7%、0.5% MC溶液的覆蓋物均未能出斑；終濃度含0.5%瓊脂糖2% FBS的覆蓋物出斑數(shù)量最多，斑點(diǎn)清晰可見；終濃度含0.7%瓊脂糖和2% FBS的覆蓋物出斑數(shù)量較少，斑點(diǎn)直徑�。唤K濃度含1%瓊脂糖和5% FBS的覆蓋物出斑數(shù)量少，斑點(diǎn)直徑大（圖1）。
2.2 FBS含量對噬斑形成的影響
2%的瓊脂糖與過濾注射用水對半混合均勻制成1%的瓊脂糖溶液，2x1640再與上述稀釋后的瓊脂糖溶液對半混合均勻，加入HEPES緩沖液、1%雙抗，再分別加入1%( 2%、3%、4%) FBS，配制成營養(yǎng)覆蓋物。HAdV-B55分別稀釋至1／105和1／106后感染12孔板中的A549細(xì)胞單層進(jìn)行噬斑實(shí)驗(yàn)，每組2個復(fù)孔。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，覆蓋物中FBS為惟一變量時，其含量對噬斑影響顯著，含1% FBS的覆蓋物在鏡下觀察第3d少量出斑，第4d出現(xiàn)大面積的細(xì)胞病變。病毒稀釋至1/10:時，含3%、4% FBS的營養(yǎng)覆蓋物出現(xiàn)較少噬斑，噬斑直徑小。病稀釋至1／106時，含2%FBS的覆蓋物出現(xiàn)邊緣整齊．清晰的噬斑，易觀察計(jì)數(shù)；含3%、4% FBS的覆蓋物噬斑面積較小、甚至無任何斑點(diǎn)，細(xì)胞狀態(tài)良好（圖2）。
2.3 營養(yǎng)覆蓋物中HEPES緩沖液對噬斑形成的影響
2x1640分別與1%的瓊脂糖對半混合均勻，配制成營養(yǎng)覆蓋物，終濃度含或不含HEPES緩沖液、l%雙抗、2% FBS。HAdV-B55分別稀釋至1／106后感染12孔板中得A549細(xì)胞單層進(jìn)行噬斑實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，覆蓋物中加入HEPES緩沖液不能顯著增加噬斑單位的形成。
2.4 HAdV-B55在A549細(xì)胞中的增殖動力學(xué)特征
病毒以MOI=10接種A549細(xì)胞，孵育l h后吸棄病毒液，換含2% FBS的維持液，分別于接種后3、6、9、12、15、18、21、24、36、48、60、72 h鏡下觀察細(xì)胞病變情況，同時收集細(xì)胞培養(yǎng)液，噬斑法分別計(jì)算病毒滴度。鏡下觀察結(jié)果顯示，接種HAdV-B55后36 h，細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變，60 h內(nèi)完全病變。噬斑實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果，HAdV-B55接種A549細(xì)胞后3～12 h病毒滴度升高得比較緩慢，接種l2 h后病毒滴度增加約2.8倍，接種后12～15 h病毒出現(xiàn)一個陡升，15h后病毒滴度增加約75倍，15—36 h病毒滴度開始呈指數(shù)增高，36 h出現(xiàn)一個陡升，36 h測定的HAdV-B55滴度較第15 h增加約333.3倍，病毒增殖速度逐漸下降，接種后第60 h病毒滴度達(dá)到平臺期，接種后72 h病毒滴度增加約225 000倍（圖3）。
3討論
細(xì)胞生長的密度和狀態(tài)是噬斑形成的關(guān)鍵因素，細(xì)胞生長密度過低，不宜形成噬斑，如果細(xì)胞噬斑直徑過小，還會影響后期計(jì)數(shù)；細(xì)胞生長密度過高或狀態(tài)不好，容易凋亡、脫落。病毒種類不同對瓊脂糖濃度的要求不同，濃度太高或太低都會影響噬斑的形成，瓊脂糖濃度越高，噬斑直徑就越小。血清的濃度是影響細(xì)胞生長代謝速度和生長狀態(tài)的關(guān)鍵因素之一，進(jìn)一步影響噬斑形成的周期，覆蓋物中血清含量過高或過低都會對病毒噬斑造成影響；另外，要保證實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性，應(yīng)盡量使用同一類型相同批號的血清。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HAclV-B55在A549細(xì)胞內(nèi)增殖周期為12～15 h，接種12 h后即有大量病毒顆粒釋放出細(xì)胞進(jìn)入培養(yǎng)液，HAdV-B55以10MOI感染A549細(xì)胞，60 h內(nèi)能使細(xì)胞完全凋亡，HAdV-B55在A549細(xì)胞中增殖代謝活動比較活躍，增殖效率高。綜上，我們建立了HAdV-55腺病毒感染A549細(xì)胞模型及噬斑實(shí)驗(yàn)檢測腺病毒滴度的方法，研究了HAdV-55腺病毒在A549中的增殖動力學(xué)特征，為探討HAdV-55的生物學(xué)特征、感染致病機(jī)制，并為后期篩選具有抗腺病毒作用的藥物及中藥活性成分提供了重要的方法學(xué)基礎(chǔ)。
