微管結(jié)合蛋白Tau磷酸化位點(diǎn)突變體的構(gòu)建及鑒定
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賈曉蒙，張亞楠，羅曉麗，陳瀅潔，丁麗華，葉棋濃，呂朝暉
1．解放軍總醫(yī)院內(nèi)分泌科，北京100853;2．軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所，北京100850
——[摘要]目的：構(gòu)建帶有Myc標(biāo)簽的Thr-213、Thr-235、Ser-404磷酸化位點(diǎn)突變?yōu)锳la的Tau蛋白真核表達(dá)質(zhì)粒，并在真核細(xì)胞中表達(dá)MyC-Tau3m蛋白。方法：利用重組PCR方法得到Thr-213、Thr-235、Ser-404磷酸化位點(diǎn)突變?yōu)锳la的編碼序列，將其插入經(jīng)Bam,H I和Kpn, I酶切的pXJ40-Myc表達(dá)載體，在人293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)入空載體和重組質(zhì)粒，利用Western印跡檢測(cè)其表達(dá)及功能。結(jié)果：測(cè)序和酶切結(jié)果證實(shí)Myc-Tau3m真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后獲得表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物可促進(jìn)微管的乙酰化。結(jié)論：構(gòu)建了Thr-213、Thr-235 .Ser-404磷酸化位點(diǎn)突變的Myc-Tau3m真核表達(dá)載體，為進(jìn)一步研究Tau蛋白磷酸化的生理機(jī)能奠定了基礎(chǔ)。
[關(guān)鍵詞]微管結(jié)合蛋白Tau；突變體；磷酸化；真核表達(dá)
Tau是一種微管結(jié)合蛋白，在全部與徽管結(jié)合的蛋白中占80%。Tau蛋白的基因位于第17號(hào)染色體的長(zhǎng)臂，共含有16個(gè)外顯子，基因全長(zhǎng)超過了100 kb，可在轉(zhuǎn)錄后通過選擇性剪輯mRNA形成6種異構(gòu)體，每個(gè)異構(gòu)體含有352～441個(gè)氨基酸殘基，蛋白中央有脯氨酸富集區(qū)。
Tau蛋白的主要生理功能是促進(jìn)微管組裝，維持微管穩(wěn)定，并支持神經(jīng)元內(nèi)的軸突運(yùn)輸功能。Tau蛋白過度磷酸化后異常聚集可導(dǎo)致Tau蛋白功能紊亂，并以配對(duì)螺旋絲的結(jié)構(gòu)形成神經(jīng)元纖維纏結(jié)，在細(xì)胞內(nèi)聚集引起微管解聚，最后使神經(jīng)元發(fā)生退行性病變。這種神經(jīng)元纖維纏結(jié)現(xiàn)象構(gòu)成了阿爾茨海默病(AD)的主要病理特征。有研究報(bào)道，AD患者腦內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)數(shù)量與臨床癡呆程度呈正相關(guān)，AD患者臨床癥狀與Tau蛋白纏結(jié)由內(nèi)嗅皮質(zhì)向海馬和大腦皮層浸潤(rùn)趨勢(shì)相一致，是目前國(guó)際評(píng)估AD病程進(jìn)展的金標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)AD發(fā)病機(jī)制的探討和治療藥物的開發(fā)是當(dāng)前AD研究的熱點(diǎn)。Tau蛋白的異常磷酸化可能是神經(jīng)元纖維退變的早期事件。在AD患者腦中和體外實(shí)驗(yàn)中都發(fā)現(xiàn)許多蛋白激酶和磷酸酯酶共同調(diào)節(jié)Tau蛋白的磷酸化。迄今，已發(fā)現(xiàn)的AD腦中的Tau蛋白異常磷酸化位點(diǎn)有21個(gè)，其中10個(gè)位點(diǎn)的磷酸化水平較高，對(duì)Tau蛋白功能影響較大。Tau蛋白的磷酸化水平受多種激酶的調(diào)節(jié)，尤其是P38 MAPK（P38絲裂原活化蛋白激酶），在Tau蛋白的磷酸化過程中起著重要作用。P38激酶活性上調(diào)是導(dǎo)致Tau蛋白異常過度磷酸化的重要原因。有報(bào)道指出，無論在體內(nèi)還是體外，P38 MAPK均能直接使Tau蛋白磷酸化。Tau蛋白共有85個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中79個(gè)為絲氨酸和蘇氨酸殘基。這些位點(diǎn)中與P38 MAPK通路相關(guān)的有Ser-46、Thr- 181、Ser- 202、Thr- 205、Thr- 212、Thr- 217、Thr-231、Ser-235、Ser- 356、Ser- 396、Ser-404，其中Thr-213、Thr-235、Ser-404位點(diǎn)在微管解聚中具有重要作用。
Tau蛋白主要與非激動(dòng)神經(jīng)元的軸突特異性結(jié)合，但當(dāng)Tau蛋白脯氨酸富集區(qū)高度磷酸化時(shí)，Tau特異性結(jié)合在神經(jīng)元胞體樹突上，因此，Tau蛋白的磷酸化位點(diǎn)在決定其結(jié)合伴侶從而實(shí)現(xiàn)特異性功能定位的過程中起著重要作用。當(dāng)Tau蛋白發(fā)生過度磷酸化時(shí)，P38 MAPK通路在Tau蛋白磷酸化中的生理作用將轉(zhuǎn)變?yōu)椴±磉^程，這種病理過程可以促進(jìn)Tau蛋白與微管解離，此時(shí)，神經(jīng)元中可溶性Tau蛋白會(huì)大量增加并引起Tau蛋白自體聚集，從而形成Tau蛋白寡聚體。這些寡聚體可以進(jìn)一步集合成雙螺旋絲，螺旋絲相互聚集最終形成阿爾茨海默病的主要病理特征之一——神經(jīng)纖維纏結(jié)。
我們擬構(gòu)建Thr-213、Thr-235、Ser-404磷酸化位點(diǎn)突變的Tau真核表達(dá)重組體，探討Tau蛋白P38磷酸化位點(diǎn)突變對(duì)微管聚合的影響。
1材料和方法
1.1材料
293T細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng)；載體為本實(shí)驗(yàn)室保存；VigoFect南威格拉斯生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶、PCR相關(guān)試劑盒由TaKaRa公司生產(chǎn)；膠體回收、質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)于Promega公司；DMEM及小牛血清購(gòu)于Gibco公司；測(cè)序由博邁德公司完成。
1.2 Myc-Tau3m重組質(zhì)粒的構(gòu)建與測(cè)序
以乳腺文庫(kù)為模板，采用上游引物(5'- GAAA ACAAGATGCTCCCAGCCAAGG-3')和下游引物（5'-CCTTGGCTGGGAGCATCTTGTTTTC-3，）PCR擴(kuò)±曾得到Ser-404位磷酸化位點(diǎn)突變的質(zhì)粒Tau404。以Tau404為模板，采用上游引物（5，- CGGGATCCATG GCTGAGCCCCGCCAG-3 7）和下游引物（5 7PTGGCG GAAGACGGCCCCTTGGGTGGACCACGGACCACTG C-3一），同時(shí)以Tau404為模板，采用上游引物（5 7一G CAGTGGTCCGTGGTCCACCCAAGGGGCCGTCTTCC GCCA-3')和下游引物（5，- GGGGTACCTCACAAACCCTGCTTGGC-3'）進(jìn)行PCR擴(kuò)增（反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min;95。C變性30 s，60qC退火30 s，72。C延伸3 min 10 s，29個(gè)循環(huán)；72C繼續(xù)延長(zhǎng)7 min），用膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。以上述步驟回收的2段片段為模板，用上游引物(5，_ CGGGATCCATGGCTGAGCCCCGCCA-3')和下游引物(5，- GGGGTACCTCACAAACCCTGCTTGGC-3')行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件相同，將PCR產(chǎn)物回收。用BamH I和Kpn, I雙酶切pXJ40-Myc載體，用10 g/L瓊脂糖電泳回收載體大片段。用BamH I和Kpn I雙酶切回收純化后的擴(kuò)增片段，選擇T。DNA連接酶將酶切片段和載體按一定比例連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，隨機(jī)挑選菌落培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，用BamH I和Kpn I對(duì)所提質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定。將酶切鑒定無誤的質(zhì)粒送北京博邁德生物公司測(cè)序。
1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和Western印跡檢測(cè)
將培養(yǎng)于含10%胎牛血清和10%雙抗的DMEM培養(yǎng)基中的293T細(xì)胞接種于6 cm培養(yǎng)皿中，轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度達(dá)80%，于轉(zhuǎn)染前1 h換液，接種24 h后轉(zhuǎn)染。把4 p4L VigoFect和200 VL NaCl混合，把2 y,g重組質(zhì)粒與200 p.L NaCl混合，將上述2種混合物混勻后室溫放置15 min，繼而加入培養(yǎng)皿中；相同條件轉(zhuǎn)染pXJ40- Myc質(zhì)粒作為對(duì)照。37。C、5% CO2常規(guī)培養(yǎng)，4h后換液；轉(zhuǎn)入質(zhì)粒后24 h收集細(xì)胞并裂解，加入2xSDS緩沖液，煮沸15 min，高速離心5 min i后取上清行SDS-PAGE并轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上；用TBST配制5010的脫脂牛奶將膜封閉1h，將HRP標(biāo)記的抗Myc抗體用上述配好的5%脫脂牛奶按1：3000稀釋；將抗GAPDH抗體按1：5000稀釋；次日把鼠抗IgG抗體用5%脫脂牛奶按l：5000稀釋，室溫輕搖2h，TBST洗膜3次x5 min;將顯影劑A液和B液按1:1混勻并附膜反應(yīng)5 min后顯影。
1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和Western印跡檢測(cè)Myc- Tau3m對(duì)tublin乙�；挠绊�
用6 cm皿培養(yǎng)293T細(xì)胞，接種量以轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度達(dá)80%為宜，培養(yǎng)24 h后進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前1 h換液。分別轉(zhuǎn)染pXJ40-Myc、Tau、Myc-Tau3m質(zhì)粒，37℃、5% CO2常規(guī)培養(yǎng)，4—6 h換液。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞24 h后收集細(xì)胞蛋白，加入2xSDS加樣緩沖液，煮沸10 min，高速離心2 min，取上清液行SDS-PAGE后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上；用5%脫脂奶粉于4℃封閉過夜，加入用5%脫脂奶粉以1：200稀釋的抗AC-tubulin鼠單克隆抗體、1:200稀釋的抗tubulin鼠多克隆抗體、1：5000稀釋的用HRP標(biāo)記的抗Myc標(biāo)簽鼠單克隆抗體，室溫輕搖th，TBST洗膜3次，每次5 min；用化學(xué)發(fā)光法顯色5 min，壓片顯影。
2結(jié)果
2.1 Myc-Tau3m重組質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定
以pXJ40-Tau為模板，PCR擴(kuò)增404位磷酸化位點(diǎn)上、下游片段，得到片段1(1200 bp)和片段2(100 bp)，并用重組PCR法將2條片段進(jìn)行連接，得到全長(zhǎng)片段(1300 bp)，即為突變體PCR產(chǎn)物S404A（圖1）。以S404A為模板，PCR擴(kuò)增Thr-213、Thr-255位磷酸化位點(diǎn)上、下游序列，得到片段3 (550bp)和片段4(500 bp)，與預(yù)期結(jié)果一致。以片段3、4為模板進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增，得到T213A/T235A/S404A突變的全長(zhǎng)序列(1300 bp)（圖2）。用BamH I和Kpn, I對(duì)片段和Myc載體進(jìn)行雙酶切，用T。DNA連接酶將酶切片段和載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑選菌落行菌液PCR，空載體酶切后僅獲得空載體，挑選的陽性克隆酶切后得到約1300 bp的目的片段（圖3），進(jìn)一步認(rèn)定篩選出了陽性Myc-Tau3m質(zhì)�？寺�。測(cè)序結(jié)果證實(shí)Thr-213、Thr-255和Ser-404成功突變?yōu)锳la。
2.2質(zhì)粒真核轉(zhuǎn)染表達(dá)鑒定
將測(cè)序無誤的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞，以HRP標(biāo)記的抗Myc標(biāo)簽鼠單克隆抗體檢測(cè)Tau的表達(dá)．West-ern印跡結(jié)果可見相對(duì)分子質(zhì)量約55Xl03處有特異性條帶，而空轉(zhuǎn)組顯示陰性（圖4）。表明Tau基因在293T細(xì)胞中得到表達(dá)。
2.3 Myc-Tau3m促進(jìn)微管蛋白的乙�；�
Tau的磷酸化抑制微管的聚合，而微管的聚合可以用微管蛋白的乙�；瘉頇z測(cè)，微管聚合的程度越高，微管蛋白的乙�；皆礁�。因此，Tau的磷酸化抑制微管蛋白的乙�；榱藱z測(cè)Myc-Tau3m對(duì)微管聚合的影響，將野生型Tau質(zhì)粒和Myc-Tau3m質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞，檢測(cè)其對(duì)微管蛋白乙�；挠绊憽＝Y(jié)果顯示，與空載體相比，Tau使微管蛋白的乙�；鰪�(qiáng)，而Myc-Tau3m進(jìn)一步增強(qiáng)了微管蛋白的乙�；▓D5）。
3討論
Tau的功能多樣，近年發(fā)現(xiàn)，Tau蛋白與腫瘤具有一定關(guān)系。國(guó)外研究表明，在乳腺癌中Tau蛋白高表達(dá)與紫杉醇耐藥有關(guān)，研究結(jié)果顯示在經(jīng)紫杉醇聯(lián)合化療并得到完全緩解的乳腺癌患者中，70%的腫瘤組織不表達(dá)Tau蛋白，而在采用他莫昔芬治療的乳腺癌患者組Tau蛋白卻呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，雌激素受體(ER)陽性患者的兀復(fù)發(fā)時(shí)間明顯更長(zhǎng)，提示Tau蛋白高表達(dá)在內(nèi)分泌治療中可以作為很有價(jià)值的預(yù)測(cè)因子�，F(xiàn)有研究證實(shí)，在神經(jīng)細(xì)胞中微管是穩(wěn)定細(xì)胞骨架和支持物質(zhì)運(yùn)輸?shù)闹饕Y(jié)構(gòu)，而Tau蛋白作為一種微管相關(guān)蛋白在此過程中扮演著重要角色。Tau的磷酸化或過度磷酸化是正常生理功能維持和神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)生中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。當(dāng)Tau蛋白發(fā)生過度磷酸后，會(huì)以配對(duì)螺旋絲的形式在細(xì)胞內(nèi)形成神經(jīng)纖維聯(lián)結(jié)并異常聚集，繼之引起神經(jīng)元的慢性退行性病變。Tau蛋白的過度磷酸化由多種激酶共同調(diào)節(jié)，其中P38 MAPK和GSK-3(3的作用最為重要。P38 MAPK除可以自身磷酸化Tau蛋白多個(gè)位點(diǎn)外，還可以通過對(duì)Tau的預(yù)磷酸化增強(qiáng)GSK-3B對(duì)Tau的磷酸化作用。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)Tau蛋白約有21個(gè)高度異常磷酸化位點(diǎn)，其中至少10個(gè)是脯氨酸指導(dǎo)的，另有15個(gè)位點(diǎn)于絲氨酸殘基上，還有6個(gè)位點(diǎn)在蘇氨酸殘基上。Tau蛋白異常磷酸化是阿爾茨海默病的主要病理過程，Tau蛋白異常磷酸化可以導(dǎo)致神經(jīng)纖維纏結(jié)的形成，P38MAPK是該病理過程中最重要的激酶之一。P38MAPK等激酶可以通過多個(gè)位點(diǎn)催化Tau磷酸化，但是對(duì)各位點(diǎn)的磷酸化作用效果卻不盡相同。雖然有很多關(guān)于Tau蛋白的報(bào)道和研究，但Tau蛋白異常磷酸化過程中各個(gè)位點(diǎn)的作用效應(yīng)并未完全闡明。
本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了Thr-213、Thr-235、Ser-404共3個(gè)磷酸化位點(diǎn)突變的克隆質(zhì)粒Myc-Tau3m，并在真核細(xì)胞中獲得表達(dá)，驗(yàn)證了其可促進(jìn)微管的乙�；崾綯au的磷酸化在乳腺癌耐藥中可能發(fā)揮作用。我們的工作為進(jìn)一步研究Tau蛋白磷酸化在乳腺癌中的功能奠定了基礎(chǔ)。
