葡聚糖凝膠色譜結(jié)合高速逆流色譜提取藍(lán)莓中花青素
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郭丹妮，向燦輝*，陳陽(yáng)*，王文君，吳鈺彬
遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)生物工程系（珠海519041）
摘要試驗(yàn)結(jié)合葡聚糖凝膠色譜及高速逆流色譜對(duì)野生藍(lán)莓中的花青素進(jìn)行了分離純化。藍(lán)莓粗提物先經(jīng)過(guò)葡聚糖凝膠色譜初步分離，得到花青素含量高的組份，再經(jīng)高速逆流色譜分離，以MTBE-正丁醇-乙腈-水(體積比1:3：1：5)為兩相溶劑體系，流速0.5 m L/min、主機(jī)轉(zhuǎn)速1 860 r/min以及檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm的條件下進(jìn)行分離，從藍(lán)莓的葡聚糖凝膠色譜柱分離產(chǎn)物中一次性分離得到兩種花青素，經(jīng)超高效液相色譜分析，2種化合物的純度分別為65.0%和90.0%。
關(guān)鍵詞藍(lán)莓；花青素；高速逆流色譜；超高效液相色譜
藍(lán)莓( Blueberry)又名越桔，是杜鵑花科( Ericaceae)越桔屬（Vaccinium Spp．）的小果漿
果樹(shù)。已有的研究表明藍(lán)莓中含有的花青素是眾多含花青素植物中性能優(yōu)良的品種之一�；ㄇ嗨�( Anthocyanin)屬于黃酮類水溶性色素，作為一種天然著色劑，在食品、化妝品等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用，特別是花青素具有很強(qiáng)的抗氧化能力，能有效清除人體代謝過(guò)程中產(chǎn)生的自由基，起到延緩衰老、保護(hù)血管、降低心血管疾病發(fā)病率、提高人體免疫力及起到防癌抗癌的作用。而藍(lán)莓中富含花青素，要對(duì)藍(lán)莓進(jìn)行相關(guān)活性研究及深加工，功能成分的分離提純是關(guān)鍵技術(shù)。因此，建立藍(lán)莓中活性成分的有效分離純化具有非常重要的意義。
高速逆流色譜是一種基于液一液分配的色譜技術(shù)，因?yàn)椴皇褂霉虘B(tài)填料，容易實(shí)現(xiàn)較大的進(jìn)樣量和制備量，同時(shí)也可以避免固態(tài)填料對(duì)樣品的不可逆吸附、污染和失活等。而且由于不使用固體填料，制備成本也因此相對(duì)降低，故近年來(lái)得到了廣泛的應(yīng)用。試驗(yàn)將結(jié)合高速逆流色譜技術(shù)和葡聚糖凝膠色譜，對(duì)藍(lán)莓中花青素進(jìn)行分離提純，建立一種快捷、簡(jiǎn)單的分離方法，為花青素的分離純化提供參考。
1試驗(yàn)部分
1.1儀器與設(shè)備
TBE-20A高速逆流色譜儀：上海同田生物技術(shù)股份有限公司；Waters AcquityUPLC M-Class超高效液相色譜儀：沃特世科技（上海）有限公司；IKA V-C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀基本型：艾卡（廣州）儀器設(shè)備有限公司；低溫冷卻循環(huán)泵：上海豫康科教儀器設(shè)備有限公司；ALPHA 2-4 LSC冷凍干燥機(jī)：德國(guó)Marin Christ公司；數(shù)顯電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海浦東榮科學(xué)儀器有限公司。
1.2試劑與材料
藍(lán)莓干果：市售；粗提物的制備及HSCCC分離用正丁醇、乙腈、甲基叔丁基醚( MTBE)：分析純；超高效液相色譜用甲醇：色譜純，美國(guó)天地公司；過(guò)濾蒸餾水。
1.3藍(lán)莓粗提物的制備
藍(lán)莓干果500 g，20倍量經(jīng)1%鹽酸酸化的體積分?jǐn)?shù)為60%乙醇分3次，水浴50℃浸泡，每次2h，合并提取液，減壓濃縮并冷凍干燥得到浸膏40.1 g，供葡聚糖凝膠柱色譜分離使用。
1.4葡聚糖凝膠色譜分離
取藍(lán)莓粗提物浸膏10.0 g，10010甲醇水溶液溶解，0.45 μm濾膜過(guò)濾，上柱用梯度甲醇-水溶液洗脫，收集洗脫液，薄層色譜法檢視，收集目標(biāo)樣品，濃縮后冷凍得6.0 g樣品，供高速逆流色譜法分離用。
1.5分配系數(shù)(K)的測(cè)定
分別量取平衡后的溶劑體系上相、下相各2.00 m L于同一試管中，加入葡聚糖凝膠色譜柱分離產(chǎn)物，充分振搖靜置分層，分別取0.20 m L上、下相溶液用UPLC進(jìn)行檢測(cè)。以上相組分峰面積（A上）與下相組分峰面積（A下）的比值計(jì)算樣品在溶劑體系中的分配系數(shù)K，計(jì)算公式：K= A上/A下。
1.6 HSCCC法分離制備過(guò)程
將經(jīng)超聲脫氣的兩相溶劑體系中固定相（上相）以5 m L/min的速度泵入高速逆流色譜儀的螺旋分離管中，待上相充滿整個(gè)螺旋管后，打開(kāi)主機(jī)，調(diào)節(jié)按鈕，使高速逆流色譜儀螺旋管柱按順時(shí)針的方向旋轉(zhuǎn)，當(dāng)轉(zhuǎn)速達(dá)到1 860 r/min時(shí)，將流動(dòng)相（下相）泵人高速逆流色譜儀，流速為0.5 m L/min，待下相流出時(shí)，平衡完畢，計(jì)算保留率（保留率=（28-V）／20×100%，其中V=V總-V下相）。葡聚糖凝膠柱分離樣品用流動(dòng)相（下相）溶解后進(jìn)樣，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，根據(jù)出峰信號(hào)及薄層色譜檢視結(jié)果收集流出液，流出液冷凍干燥后進(jìn)行UPLC分析。
1.7 UPLC分析條件
色譜柱：反相C18柱(2.1 mm×50 mm，T3 1.8m)；流動(dòng)相A：0.1%三氟乙酸水溶液；流動(dòng)相B：乙腈；梯度洗脫程序：0～6.12 min，10%～60%B；6.12～8min，60%～l0%B；流速：0.61 m L/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：0.2 m L。
1.8對(duì)目標(biāo)分離產(chǎn)物的分析
高速逆流色譜分離得到的樣品經(jīng)UPLC、薄層及顯色反應(yīng)進(jìn)行定量、定性分析。
2結(jié)果與討論
2.1 選擇HSCCC分離條件
高速逆流色譜中選擇合適的溶劑系統(tǒng)是成功分離樣品的重要條件，溶劑系統(tǒng)的選擇可以通過(guò)測(cè)定分配系數(shù)K來(lái)確定，K值的合適值為0.5～2.0之間，此外，還需滿足溶劑體系分層時(shí)間短(一般要求不超過(guò)30s)，保留率>30%。試驗(yàn)比較了4個(gè)溶劑體系的K值(n=5)，結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果表明，在體系1中，2種花青素的K值均為2.2，超出了理想K值范圍，過(guò)大的K值會(huì)導(dǎo)致出峰時(shí)間長(zhǎng)，分離效率低。在溶劑體系2～4中，2種花青素的K值分別均在0.5～2之間。但溶劑體系2的固定相保留率為26%，小于正常固定相保留率( >30%)，過(guò)低的固定相保留率會(huì)導(dǎo)致固定相的流失，不利于樣品的分離，達(dá)不到理想的分離效果。而溶劑體系3、4的固體保留率分別為50%和70%，均大于30%，最后經(jīng)上機(jī)分離樣品的結(jié)果表明溶劑體系3分離效果不理想。而采用溶劑體系4對(duì)樣品進(jìn)行分離，經(jīng)UPLC及薄層色譜檢視，分離效果良好，故試驗(yàn)采用溶劑體系4作為高速逆流色譜的分離溶劑體系。
2.2 HSCCC分離結(jié)果
以MTBE-正丁醇-乙腈-水（體積比1：3：1:5）為兩相溶劑體系，按照試驗(yàn)部分1.6所述方法對(duì)葡聚糖凝膠色譜柱分離產(chǎn)物進(jìn)行分離純化。取葡聚糖凝膠色譜柱分離產(chǎn)物置于試管內(nèi)，加入下相振搖溶解后經(jīng)HSCCC進(jìn)行分離，HSCCC結(jié)果見(jiàn)圖1。流出液經(jīng)薄層色譜(聚酰胺板，展開(kāi)劑：正丁醇-醋酸-水(體積比8:2：1》及UPLC檢測(cè)，圖1中峰1和峰2部分為純度較高的組分，減壓濃縮、冷凍干燥后得5 mg樣品1和6mg樣品2。
2.3 UPLC分析結(jié)果
采用乙腈-0.1%三氟乙酸水溶液作為流動(dòng)相，取野生藍(lán)莓葡聚糖凝膠色譜粗提物、樣品1和樣品2用甲醇（色譜級(jí)）溶解并過(guò)0.45 μm濾膜后，經(jīng)UPLC分析，結(jié)果見(jiàn)圖2。圖2A表明目標(biāo)成分可以得到良好的分離，圖2B和2C表明經(jīng)過(guò)一次HSCCC分離之后，得到了純度較高的樣品1和樣品2。利用面積歸一法（A=A物質(zhì)的峰面積／所有出峰物質(zhì)的總峰面積×100%），計(jì)算得化合物1和2的純度分別為65.0%和90.0%。
2.4 目標(biāo)分離產(chǎn)物的定性鑒別結(jié)果
用1%鹽酸乙醇溶解樣品1和樣品2后分別觀察其溶液顏色，發(fā)現(xiàn)均為紅色，調(diào)節(jié)pH至堿性顯藍(lán)色，此顏色變化符合花青素的化學(xué)性質(zhì)。 將化合物1和化合物2按照方法1.7節(jié)UPLC分析條件進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)兩者的光譜圖中276.7 nm處均有較強(qiáng)吸收，而花青素分子中存在高度分子共軛體系，在280 nm附近有較強(qiáng)吸收，由此可推斷樣品l和樣品2可能是花青素。
3結(jié)論
試驗(yàn)采用MTBE-正丁醇-乙腈-水(體積比1:3：1：5)為兩相溶劑體系，經(jīng)高速逆流色譜從藍(lán)莓中一次性分離得到了兩個(gè)純度較高的花青素樣品，純度分別為65.0%和90.0%。具有快捷、簡(jiǎn)便等特點(diǎn)。應(yīng)用高速逆流色譜法從藍(lán)莓中分離提取花青素的文獻(xiàn)報(bào)道甚少，該研究為藍(lán)莓中花青素的分離制備提供了一種實(shí)用、新型的方法，并為HSCCC分離高極性化合物提供了思路。
