鈉碘同向轉(zhuǎn)運(yùn)體上游增強(qiáng)子序列的特異性結(jié)合蛋白文庫(kù)的構(gòu)建及初步篩選
相關(guān)鏈接： 中國(guó)安全網(wǎng) 中國(guó)質(zhì)量網(wǎng) 中國(guó)論文網(wǎng) 中國(guó)資訊網(wǎng)
邱立紅，靳彥文，方毅，付洋波，白圓圓，顏芳，朱貴明，曹誠(chéng)
1．佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江佳木斯154007;
2．軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所，北京100850
——
[摘要]目的：構(gòu)建酵母單雜交文庫(kù)，篩選出與鈉碘同向轉(zhuǎn)運(yùn)體上游增強(qiáng)子(NLE)特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)分子，進(jìn)一步研究其與NUE相互作用的分子機(jī)制。方法：應(yīng)用酵母單雜交系統(tǒng)，以NUF,為酵母單雜交的“誘餌”，對(duì)甲狀腺癌Kl細(xì)胞的。DNA文庫(kù)進(jìn)行初步篩選，采用DNA測(cè)序技術(shù)及生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)篩選的克隆進(jìn)行進(jìn)一步功能分析。結(jié)果：對(duì)文庫(kù)中的陽(yáng)性克隆測(cè)序，獲得53條可讀序列，Blast X比對(duì)分析及基因功能注釋發(fā)現(xiàn)其中11條具有DNA結(jié)合功能，包括RhoGrrp酶激活蛋白35(ARHGAP35)、鋅指蛋白394(ZNF394)、上游刺激因子2(USF2) .SOX9等結(jié)論：應(yīng)用酵母單雜交技術(shù)初步篩選出與甲狀腺癌Kl細(xì)胞NUE相互作用的候選蛋白，并對(duì)這些蛋白質(zhì)進(jìn)行了初步的功能分析。
[關(guān)鍵詞]鈉碘同向轉(zhuǎn)運(yùn)體上游增強(qiáng)子；酵母單雜交；cDlA文庫(kù)
甲狀腺濾泡細(xì)胞一個(gè)主要的功能是能利用碘合成甲狀腺激素。在這一過(guò)程中，碘通過(guò)位于細(xì)胞基底膜上的鈉碘同向轉(zhuǎn)運(yùn)體(sodium iodide symport-er，NIS)轉(zhuǎn)運(yùn)到濾泡細(xì)胞中，這是甲狀腺激素合成的第一步。甲狀腺具有強(qiáng)大的濃聚碘的能力，這一特點(diǎn)是利用放射性碘進(jìn)行甲狀腺疾病顯像診斷和甲狀腺疾病治療的基礎(chǔ)。甲狀腺癌是內(nèi)分泌系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，它的發(fā)病率正逐年上升。有研究表明，與正常甲狀腺組織相比，甲狀腺癌組織對(duì)碘的攝取顯著減少，并且NIS在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平也有明顯減少，導(dǎo)致癌組織不能聚集足夠的放射碘，從而給治療帶來(lái)一定的困難。腫瘤中NIS活性減少與預(yù)后不良有關(guān)，確定與NIS活性相關(guān)的因子對(duì)提高放射性碘治療至關(guān)重要。
在甲狀腺中，促甲狀腺激素(TSH)是調(diào)節(jié)NIS表達(dá)的主要作用因子，促甲狀腺激素受體(TSHR)通過(guò)Gs蛋白激活腺苷酸環(huán)化酶，使環(huán)腺苷酸(cAMP)在甲狀腺細(xì)胞中積累，而cAMP能刺激NIS的順式作用元件相關(guān)的一些信號(hào)通路，促進(jìn)NIS轉(zhuǎn)錄，其中鈉碘同向轉(zhuǎn)運(yùn)體上游增強(qiáng)子(soclium iodide symport-er upstream enhancer，NUE)是對(duì)TSH應(yīng)答最明顯的順式作用元件。NUF位于人類19號(hào)染色體NIS基因編碼區(qū)上游9242～9300處，包括一個(gè)配對(duì)盒基因8(paired box gene 8，PAX8)結(jié)合位點(diǎn)和一個(gè)cAMP應(yīng)答元件結(jié)合蛋白(CREB)位點(diǎn)，這2個(gè)位點(diǎn)是NUE發(fā)揮全部活性所必需的。CREB是一個(gè)堿性亮氨酸拉鏈(B-ZIP)轉(zhuǎn)錄因子，包含一個(gè)亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域能調(diào)節(jié)DNA的結(jié)合，并能與其他B-ZIP蛋白形成同源或異源二聚體，而其他的蛋白或轉(zhuǎn)錄因子或許參與NUE的激活。PAX8是甲狀腺發(fā)育和分化的一個(gè)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，甲狀腺特異表達(dá)基因NIS的轉(zhuǎn)錄依賴于PAX8的活性。PAX8結(jié)合到NUE上來(lái)應(yīng)答TSH刺激是激活NUE的主要過(guò)程。NUE是NIS的重要調(diào)節(jié)元件，它的表達(dá)能直接對(duì)NIS的表達(dá)產(chǎn)生影響。因此，了解其作用機(jī)制，對(duì)從分子水平上解釋NIS在甲狀腺癌中表達(dá)減少有重要意義。
酵母單雜交系統(tǒng)是近年發(fā)展起來(lái)的研究DNA與蛋白質(zhì)相互作用的有效方法之一，其原理是根據(jù)在細(xì)胞內(nèi)DNA結(jié)合蛋白與DNA順式作用元件結(jié)合調(diào)控報(bào)告基因的表達(dá)，從而確定與DNA相互作用的蛋白質(zhì)。在此，我們采用酵母單雜交系統(tǒng)，以NUE為誘餌，從甲狀腺癌Kl細(xì)胞的cDNA表達(dá)文庫(kù)中篩選與NUE特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)，以期為NUE與甲狀腺癌的分子機(jī)制研究提供線索。
1 材料與方法
1.1材料
乳頭狀甲狀腺癌K1細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存；大腸桿菌DH5a感受態(tài)菌株、DNA marker、大腸桿菌質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)白天根生物科技有限公司；T。DNA連接酶及限制性內(nèi)切酶購(gòu)白NEB公司；凝膠回收DNA試劑盒購(gòu)自QIAGFN公司；PCR試劑盒購(gòu)自TaKa-Ra；酵母單雜交試劑盒，酵母質(zhì)粒提取試劑盒(EasyYeast Plasmid isolation Kit),YPDA、SD/- Ura及SD/-Leu培養(yǎng)基及AbA抗生素均購(gòu)自Clontech公司；PCR引物由北京奧科鼎盛生物生物科技有限公司合成；LB培養(yǎng)基、氨芐西林(Amp)、PBS等相關(guān)溶液的配制及操作按照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》進(jìn)行。
1.2酵母單雜交誘餌質(zhì)粒載體pAbAi-NUE的構(gòu)建
合成含HindⅢ、XhoI粘性末端的NUE序列（正向序列為5，-AGCTTCAGTTCCACGTGAGTGCCCTG GGGGACTCCCCTGGAGGGAAGTGCCTGCTCTGAC GCACJGAGC-3-，反向序列為5，-TCGAGCTCCTGCG TCAGAGCAGGCACTTCCCTCCAGGGGAGTCCCCCA GGGCACTCACGTGGAACTGA-3 7，將2條單鏈退火合成雙鏈NUE），用限制性內(nèi)切酶HindⅢ、Xho I雙酶切pAbAi載體，與雙鏈NUE序列連接為重組載體pAbAi-NUE，PCR鑒定該重組載體（PCR鑒定正向引物為5，-AGGTTTTGTTCTGTGCAGTTGG-3'，反向引物為5'- CTTGTTTCTAAATCCGCrrACATGGC_ 3，,產(chǎn)物為478 bp。反應(yīng)條件：940C預(yù)變性3 min;980C 10 s，55℃30 s，680C1 min，30個(gè)循環(huán)；68℃7 min)，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，陽(yáng)性質(zhì)粒送奧科鼎盛生物科技有限公司測(cè)序。
1.3報(bào)告酵母的制備
pAbAi- NUE經(jīng)BstB I單酶切線性化后轉(zhuǎn)入YIHGold酵母中，用SD/-Ura選擇培養(yǎng)基于30。C培養(yǎng)3—5 d，形成誘餌菌株YIHGoldl Bait-pAbAi]，挑取大的單菌落于PCR管中，用Clontech試劑盒Match-maker Insert Check PCR Mixl做菌液PCR鑒定，l%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，以p53-AbAi為陽(yáng)性對(duì)照。
1.4酵母自激活驗(yàn)證
挑YIHGold[ Bait-pAbAi]的單克隆懸浮于0.9c/cNaCl溶液中，并分別涂板在SD/- Ura、SD/-Ura+AbA(100 ng/mL)、SD/-Ura+AbA( 200 ng/ml_,)、SD/-Ura+AbA(300 ng/mL)、SD/-Ura+AbA( 400 ng/mL)、SD/-Ura+AbA(500 ng/mL)培養(yǎng)基中，30。C培養(yǎng)3—5（1，以篩選誘餌菌株的自激活活性。
1.5文庫(kù)構(gòu)建
用QIAGEN公司的RNeasy Mini Kit提取乳頭狀甲狀腺癌Kl細(xì)胞總RNA;取1ug總RNA為模板，以O(shè)ligo( dT)為引物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，Long distance PCR反應(yīng)合成雙鏈SMART clscDNA[具體步驟參照Clontech公司的Matchmaker GoldYeast One-Hybrid Library Screening System產(chǎn)品說(shuō)明書），用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)cDNA文庫(kù)質(zhì)量。
1.6文庫(kù)轉(zhuǎn)化
用SMART dscDNA 20 yL、pGADT7-Rec ADCloning Vector 6poL、PEG/LiAc溶液2.5 mL、變性的Yeastmaker Carrier DNA 20 p*L共轉(zhuǎn)化誘餌酵母感受態(tài)600uL，轉(zhuǎn)化液分別稀釋至1/10、1/100和1／1000，并涂布在亮氨酸缺陷的SD/- Leu選擇培養(yǎng)基上，統(tǒng)計(jì)篩選的總克隆數(shù)以計(jì)算文庫(kù)滴度（總克隆數(shù)=cfu/涂板體積×稀釋率×細(xì)胞懸液總體積）。將剩余懸液涂布于添加AbA抗生素的SD/- Leu培養(yǎng)基上，其中AbA的濃度參照酵母自激活所篩選出的濃度，30。C培養(yǎng)3—5 d。
1.7酵母單雜交的初步篩選
挑選陽(yáng)性克隆較大者轉(zhuǎn)涂于新的選擇平板，進(jìn)行單菌落純化，300C培養(yǎng)3—5 ci后挑取大的純化的單菌落于PCR管中，用Clontech試劑盒MatchmakerInsert Check PCR Mix2做菌液PCR鑒定，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
1.8 陽(yáng)性克隆的復(fù)篩
將Colony PCR鑒定為陽(yáng)性的克隆送北京奧科鼎盛生物科技有限公司測(cè)序，測(cè)序引物分別為5T7(5'- TAATACGACTCACTATAGGGCGA- 3')和3AD（5，-ACATGGTGCACGATGCACAG-3'），將測(cè)序結(jié)果在NCBI( http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)網(wǎng)站進(jìn)行Blast序列比對(duì)，初步分析cDNA插入序列。為避免假陽(yáng)性，對(duì)得到的陽(yáng)性克隆再次進(jìn)行鑒定，即從這些陽(yáng)性克隆中抽提酵母質(zhì)粒，轉(zhuǎn)人大腸桿菌DH5ce中擴(kuò)增，從中抽提質(zhì)粒DNA，將它們重新轉(zhuǎn)化YIHGold及YIHGolcl[ Bait-pAbAi]酵母感受態(tài)細(xì)胞，涂布在SD/-Leu+AbA(500 ng/mL)培養(yǎng)基上，30。C培養(yǎng)3—5 d，然后對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行功能注釋分析。
2結(jié)果
2.1 誘餌載體的構(gòu)建及抗性篩選結(jié)果
對(duì)pAbAi-NUE進(jìn)行PCR鑒定，PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為478 bp（圖1A）；對(duì)陽(yáng)性質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明NUE序列（5'- CAGTTCCACGTGAGTGCCCTGGGG GACTCCCCTGGAGGGAAGTGCCTGCTCTGACGCAGGAG-3'）已連接到pAbAi載體上，誘餌載體pAbAi-NUE構(gòu)建成功（圖1B）。
2.2重組酵母的篩選
將誘餌載體pAbAi-NUE經(jīng)BstB I單酶切后轉(zhuǎn)化酵母菌株YIHGold感受態(tài)細(xì)胞，并在SD/- Ura培養(yǎng)基上培養(yǎng)，30cc培養(yǎng)3～5 d后長(zhǎng)出陽(yáng)性克隆，表明誘餌載體質(zhì)粒已轉(zhuǎn)入酵母。用Clontech公司的MatChmaker Insert Check PCR Mixl試劑盒對(duì)誘餌菌株YIHGold[Bait-pAbAi]做Colony PCR鑒定，結(jié)果表明重組酵母YIHGold l Bait-pAbAi]構(gòu)建成功（圖2）。
2.3 酵母自激活驗(yàn)證
將YIHGold[ Bait-pAbAi]單克隆分別涂布在1.4所述培養(yǎng)基上，對(duì)酵母進(jìn)行白激活活性篩選。結(jié)果表明，當(dāng)AbA濃度為400 ng/mL時(shí)幾乎無(wú)任何酵母菌斑產(chǎn)生，說(shuō)明幾乎無(wú)酵母內(nèi)源蛋白與NUE結(jié)合（圖3）。為確保出現(xiàn)的假陽(yáng)性率最低，選擇500 ng/mL作為文庫(kù)篩選時(shí)的AbA濃度。
2.4 cDNA文庫(kù)的構(gòu)建與質(zhì)量鑒定
采用RNeasy Mini Kit試劑盒提取Kl細(xì)胞的總RNA，由1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果可知，總RNA的28S、18S和SS rRNA條帶清晰，且28S亮度約為18S的2倍（圖4A），說(shuō)明總RNA質(zhì)量較好，沒有發(fā)生降解和污染，可用于構(gòu)建cDNA文庫(kù)。而cDNA文庫(kù)的彌散范圍為300—1500 bp，在該彌散范圍內(nèi)篩選到的插入片段較長(zhǎng)（圖4B），說(shuō)明所構(gòu)建的cDNA文庫(kù)合格。
2.5 酵母單雜交的初篩結(jié)果
將SMART dscDNA和線性化的pGADT7- RecAD cloning vector共轉(zhuǎn)化YIHGold[ Bait-pAbAi]感受態(tài)細(xì)胞，并涂布于SD/-Leu+AbA(500 ng/mL)培養(yǎng)基上進(jìn)行cDNA文庫(kù)的初步篩選。將共轉(zhuǎn)化液稀釋至1/100時(shí)，可長(zhǎng)出216個(gè)單克隆，通過(guò)計(jì)算可知文庫(kù)滴度為3.2sxi06大于1.oxi06，表明cDNA文庫(kù)的滴度符合要求，酵母單雜交文庫(kù)構(gòu)建成功。此外，經(jīng)過(guò)重新涂板長(zhǎng)出的單克隆再經(jīng)Colony PCR鑒定(圖5)，得到的陽(yáng)性克隆用于進(jìn)一步篩選。
2.6 陽(yáng)性克隆的測(cè)序及分析
選取300個(gè)Colony PCR鑒定為陽(yáng)性的克隆送奧科鼎盛生物公司測(cè)序，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，去除低質(zhì)量及冗余序列并與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast比對(duì)后，共獲得53條可讀序列。為進(jìn)一步驗(yàn)證陽(yáng)性克隆的可靠性，我們對(duì)陽(yáng)性克隆提取酵母質(zhì)粒，將酵母質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a并提取擴(kuò)增的質(zhì)粒重新轉(zhuǎn)化YIHGold及YIHGolcl[ Bait-pAbAi]感受態(tài)細(xì)胞，分別涂布在SD/-Leu+AbA(500 ng/mL)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化YIHGold[ Bait-pAbAi]感受態(tài)細(xì)胞的質(zhì)粒能在該培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)，而轉(zhuǎn)化YIHGold感受態(tài)細(xì)胞的質(zhì)粒不能在該培養(yǎng)基E生長(zhǎng)。對(duì)這些陽(yáng)性克隆序列用NCBI( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)、UniProt( http://www.uniprot.org/)和DAVID( https://da-vid．ncifcrf.gov/)等數(shù)據(jù)庫(kù)相關(guān)程序與軟件進(jìn)行功能注釋，發(fā)現(xiàn)1 1個(gè)具有DNA結(jié)合功能的蛋白質(zhì)(圖6)，包括Rho GTP酶激活蛋白35(Rho GTPase acti-vatlng protein 35，ARHGAP35)、鋅指蛋白394( Zincfinger protein 394，ZNF394)、上游刺激因子2(up-stream stimulator factor 2,USF2)，SOX9 (SRY- re-lated high mobility group-box gene 9)等。
其中SOX9是一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，在各種生理及病理學(xué)過(guò)程中均有重要作用。SOX9基因表達(dá)上調(diào)能增加Akt的磷酸化水平”oI，而Akt的磷酸化能激活PI3K-AKT相關(guān)信號(hào)通路，促進(jìn)甲狀腺癌的發(fā)生與發(fā)展。此外，PI3K的抑制劑能刺激甲狀腺細(xì)胞中鈉碘同向轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)及碘的攝取。
USF2為堿性一螺旋一環(huán)一螺旋一亮氨酸拉鏈(ba-sic- helix-loop- helix-leucinezipper. b- HLH- LZ)轉(zhuǎn)錄因子家族成員r”、，有一個(gè)DNA結(jié)合區(qū)、一個(gè)螺旋一環(huán)一螺旋( HLH)模體和一個(gè)亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)(Zip)，它的最主要的生理功能是作為轉(zhuǎn)錄因子，與啟動(dòng)子中含有E-box序列(CANNTG)的靶基因結(jié)合，從而調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)。
因此，我們認(rèn)為SOX9基因可能與NUE結(jié)合，抑制NUE的增強(qiáng)作用，進(jìn)而對(duì)NIS mRNA的表達(dá)起抑制作用；而USF2蛋白的B-Zip結(jié)構(gòu)域可能與NUE結(jié)構(gòu)中CREB的B-Zip結(jié)構(gòu)域形成同源或異源二聚體，參與NUE的激活，從而提高NIS的表達(dá)，進(jìn)一步提高放射碘治療的有效性。但這種可能的作用方式，需要后續(xù)實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)一步證實(shí)。
3討論
甲狀腺癌是最常見的內(nèi)分泌腫瘤，由于甲狀腺濾泡細(xì)胞可以利用碘合成甲狀腺激素，放射碘131成為治療分化型甲狀腺癌的主要手段。放射碘對(duì)甲狀腺癌的治療依賴于甲狀腺的攝碘能力，它能通過(guò)質(zhì)膜上的鈉碘同向轉(zhuǎn)運(yùn)體轉(zhuǎn)運(yùn)到癌細(xì)胞并發(fā)揮局部破壞作用。然而一些研究表明，與正常甲狀腺組織相比，甲狀腺癌組織中NIS的mRNA和蛋白表達(dá)減少，使有些癌癥患者喪失了攝碘能力，從而不能應(yīng)用這種物理療法進(jìn)行治療。如果能闡明NIS基因表達(dá)的分子機(jī)制，可能會(huì)提高NIS在甲狀腺癌中的表達(dá)量，從而顯著改善這種治療無(wú)效的狀況。
在甲狀腺中，TSH是NIS基因表達(dá)的主要刺激物，內(nèi)源或外源的TSH能增加NIS的表達(dá)來(lái)提高放射碘治療的有效性。TSH通過(guò)cAMP信號(hào)通路調(diào)節(jié)NIS mRNA和蛋白的表達(dá)。TSH在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平均能上調(diào)NIS的表達(dá)，TSH通過(guò)刺激NIS上游增強(qiáng)子，增加NIS蛋白的半衰期，并刺激NIS轉(zhuǎn)運(yùn)到質(zhì)膜上。
轉(zhuǎn)錄因子是調(diào)控真核生物基因表達(dá)的重要因子，典型的轉(zhuǎn)錄因子都有DNA結(jié)合區(qū)，不同的轉(zhuǎn)錄因子與靶基因啟動(dòng)子的順式作用元件特異性結(jié)合并相互作用，從而激活或抑制靶基因的表達(dá)。在研究DNA-蛋白質(zhì)之間相互作用的技術(shù)中，酵母單雜交技術(shù)是一種體內(nèi)鑒定DNA與蛋白質(zhì)相互作用的有效方法，它能直接從基因文庫(kù)中找到編碼蛋白質(zhì)的DNA序列。此外，用該系統(tǒng)篩選到的蛋白質(zhì)是在體內(nèi)相對(duì)自然條件下有結(jié)合功能的蛋白質(zhì)，比其他體外技術(shù)獲得的結(jié)果更能體現(xiàn)真核內(nèi)基因表達(dá)調(diào)控的真實(shí)情況。當(dāng)然，酵母單雜交作為一種研究蛋白
質(zhì)與DNA相互作用的初步實(shí)驗(yàn)技術(shù)手段，其結(jié)果還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。
我們以NUE為誘餌，從甲狀腺癌Kl細(xì)胞cDNA融合表達(dá)文庫(kù)中釣取Kl細(xì)胞中能與NUE結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子。結(jié)果表明誘餌載體pAbAi-NUE和cDNA融合表達(dá)載體pGADT7-Rec AD Cloning Vector共同轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞的效率為3.25Xl06，達(dá)到了酵母單雜交所需要的文庫(kù)滴度，并日．在SD/- Leu+AbA( 500ng/mL)培養(yǎng)基上也篩選到大量克隆。對(duì)其中的300個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，獲得53條可讀序列。鑒于酵母單雜交文庫(kù)假陽(yáng)性高的缺點(diǎn)，我們將選擇的陽(yáng)性
克隆在SD/-Leu+AbA( 500 ng/mL)培養(yǎng)基劃線后提取酵母質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a擴(kuò)增后提取質(zhì)粒，再重新轉(zhuǎn)化YIHGolcl[Bait-pAbAi]及YIHGold酵母感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)在SD/-Leu+AbA(500 ng/mL)培養(yǎng)基中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化YIHGold lBait-pAbAi]的質(zhì)粒在該培養(yǎng)基中能正常生長(zhǎng)，而轉(zhuǎn)化YIHGold的質(zhì)粒則不能長(zhǎng)出克隆。對(duì)上述53條序列進(jìn)行功能注釋分析，發(fā)現(xiàn)它們編碼的蛋白質(zhì)中有1 1個(gè)具有DNA結(jié)合功能，包括Rho GTP酶激活蛋白35、鋅指
蛋白394、上游刺激因子2等。
綜上，我們構(gòu)建了Kl細(xì)胞特異性表達(dá)順式元件結(jié)合蛋白酵母單雜交文庫(kù)，為克隆和分離Kl細(xì)胞中特異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子提供了候選基因，為分析這些候選基因與NUE的作用機(jī)制，以及對(duì)NIS表達(dá)的調(diào)節(jié)進(jìn)行深入研究奠定了基礎(chǔ)。
