過(guò)表達(dá)SGK3肝癌細(xì)胞BEL-7402在去甾體激素血清中的抗凋亡研究
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呂文杰，王洪濤，黃芳，王健，王芃，洪鎏，周建光，潘耀振，李山虎
1．貴州醫(yī)科大學(xué)，貴州貴陽(yáng)550001；2．軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所，北京100850
——《生物技術(shù)通訊》
[摘要]目的：構(gòu)建過(guò)表達(dá)血清與糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)激酶3 (SCJK3)的質(zhì)粒以及穩(wěn)定表達(dá)SCK3的肝癌細(xì)胞系BEI。一7402，研究其在去甾體激素胎牛血清(FBS)中的抗凋亡能力。方法：PCR擴(kuò)增SCK3基因，將擴(kuò)增產(chǎn)物連接到pCDH載體，構(gòu)建出pCDH-SCJK3的慢病毒載體質(zhì)粒，將其同空白對(duì)照pCDH-NC分別與慢病毒包裝載體共轉(zhuǎn)入29 3'l'細(xì)胞，包裝成慢病毒pCHD-SGK3和pCDH-NC；將構(gòu)建的慢病毒感染肝癌細(xì)胞BEL-7402并用嘌呤霉素篩選，Western印跡檢測(cè)SGK3的表達(dá)；觀(guān)察細(xì)胞在FBS及去甾體激素FBS中的生長(zhǎng)情況。結(jié)果：包裝出pCDH-SGK3重組慢病毒，此慢病毒感染肝癌細(xì)胞系BEL-7402后獲得表達(dá)；CCK8實(shí)驗(yàn)表明過(guò)表達(dá)SCK3可促進(jìn)肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，BEL-7042細(xì)胞中有雄激素的表達(dá)，去甾體激素FBS中細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制，過(guò)表達(dá)SGK3可增強(qiáng)肝癌細(xì)胞在去甾體激素血清中的抗凋亡能力。結(jié)論：在肝癌細(xì)胞BEL-7402中過(guò)表達(dá)SGK3可促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，可增強(qiáng)細(xì)胞在去甾體激素FBS中的抗凋亡能力。
[關(guān)鍵詞]血清與糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)激酶3；肝癌；BEL-7402細(xì)胞；去甾體激素胎牛血清
原發(fā)性肝癌包括肝細(xì)胞癌、肝母細(xì)胞瘤、肝血管肉瘤和膽管上皮癌，其中肝細(xì)胞癌占80%，一直以來(lái)是第三大癌病死因，也是世界第六大癌病。已有學(xué)者報(bào)道肝癌細(xì)胞的發(fā)病率有明顯的性別差異，并且有研究證明雄激素受體(androgen receptor，AR)在其中起著重要作用。有學(xué)者指出雄激素受體在肝癌患者中表達(dá)，并且AR(+)組癌癥復(fù)發(fā)率較AR（一）組高，患者預(yù)后前者也較后者差，肝癌患者中較高的血清睪酮水平預(yù)示著更高的5年腫瘤再發(fā)率和糟糕的長(zhǎng)期預(yù)后l61。血清與糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)激酶3(serum and glucorticoid regulated kinase 3,SGK3)是近年來(lái)逐漸受到重視的激酶分子，研究表明其在乳腺癌細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞等的生長(zhǎng)調(diào)控中扮演重要角色。SGK3是AGC家族的絲氨酸／蘇氨酸激酶，通過(guò)PI3K途徑被激活。SGK家族與AKT家族擁有相似的結(jié)構(gòu)域，并且其激酶區(qū)域擁有相似的識(shí)別性，這使得SGK與AKT在體外能識(shí)別相同模體，在體內(nèi)有相同的底物。SGK在細(xì)胞中參
與生長(zhǎng)、增殖、存活和遷移等多種生理作用。本實(shí)驗(yàn)意在建立過(guò)表達(dá)SGK3的細(xì)胞系，并探究肝細(xì)胞在去甾體激素血清中的生長(zhǎng)情況以及過(guò)表達(dá)SGK3的肝癌細(xì)胞在去甾體激素血清中的抗凋亡能力。
1 材料與方法
1.1材料
BEL-7402細(xì)胞、C4-2細(xì)胞、pCDH載體均為本實(shí)驗(yàn)室保存；胎牛血清( FBS)、DMEM購(gòu)于Gibco公司；T。DNA連接酶及其緩沖液，限制性?xún)?nèi)切酶BamH I、NotI、EcoR I購(gòu)白TaKaRa公司；質(zhì)粒提取試劑盒及Vigofect轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Vigorous公司；膠回收試劑盒購(gòu)白Axgen公司；CCK-8試劑盒購(gòu)自DOJINDO公司；ULybre,ne購(gòu)白Santa Cruz公司；嘌呤霉素、活性炭購(gòu)白Sigma公司；Dextran T-70購(gòu)自Solarbio公司；SGK3、v微管蛋白(^y-tubulin)抗體購(gòu)自Cell Si-galling公司；山羊抗兔、兔抗山羊抗體購(gòu)自中杉金橋公司；Western印跡發(fā)光液購(gòu)自TIANGEN公司。
1.2去甾體激素FBS的制備
使用前用去離子水清洗活性炭，配制含0.5%Dextran T-70和5%活性炭的FBS 45 mL，56。C水浴箱孵育30 min，間斷混勻，然后置于旋轉(zhuǎn)搖床4℃過(guò)夜，次日用0.22um濾膜過(guò)濾除菌，收集濾液即為去甾體激素的FBS(CSS)。
1.3 質(zhì)粒的構(gòu)建
以實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有SGK3質(zhì)粒為模板，在NCBI上查找SGK3 DNA序列，在其上、下游分別添加相應(yīng)酶切位點(diǎn)與保護(hù)性堿基，構(gòu)建序列SGK3-F（5'- CGGGATCCCAAAGAGATCACACCATG-3 7）和SGK3-R(5'-GAGCGGCCGCCAAAAATAAGTCTTCTGAAGG-3').PCR擴(kuò)增體系：模板0.5 uL，SGK3-F、SGK3-R各1uL，dNTP1uL．Pfu酶緩沖液2uL，Pfu酶0.4uL，ddH：0 14.1 uL。擴(kuò)增程序：預(yù)變性94。C3 min，變性95。C 30 s，600C 30 s，72。C 1.4 min，以無(wú)引物體系為空白對(duì)照，進(jìn)行32個(gè)循環(huán)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。1010瓊脂糖凝膠電泳鑒定并用膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。用Barn,H I和NotI對(duì)擴(kuò)增片段（28.5uL膠回收產(chǎn)物，BamH I、Not I各0.35ILL，緩沖液K 1.75UL，BSA 3.5 UL）和載體（1ug載體，BamH I、NotI各0.35 uL，緩沖液K 1uL，BSA 2uL，加ddH：0至20ILL）過(guò)夜酶切，酶切產(chǎn)物直接回收，與T。DNA連接酶過(guò)夜連接（酶切回收產(chǎn)物15 UL，T。DNA連接酶0.4 uL，T。DNA連接酶緩沖液2uL，ddH：02.6 uL)，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，涂板培養(yǎng)，挑取菌落于37。C振蕩培養(yǎng)，經(jīng)菌液PCR鑒定，送公司測(cè)序，選擇成功連接到載體的菌液樣品提取質(zhì)粒，即獲得pCDH-SGK3質(zhì)粒。
1.4慢病毒的包裝
用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染前1d傳至10 cm培養(yǎng)皿中，待其密度長(zhǎng)至70%～80%，更換新鮮培養(yǎng)液，用PEI轉(zhuǎn)染試劑將質(zhì)粒pSPA- 2G、pXA- X2及pCDH空載體(pCDH-NC)、pCDH-SGK3分別共轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞，次日更換為新鮮培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)染后24 h收集一次培養(yǎng)液，即為病毒毒液，更換新鮮培養(yǎng)液待48 h以后再次收集病毒毒液，將2次收集的毒液于1700 r/min離心3 min，吸取細(xì)胞沉淀，以0.45 um濾膜過(guò)濾后，置-80℃冰箱保存。
1.5過(guò)表達(dá)SGK3肝癌細(xì)胞株的構(gòu)建
用含10% FBS的DMED培養(yǎng)液在10 cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)BEL-7402細(xì)胞，感染前進(jìn)行細(xì)胞傳代，待細(xì)胞生長(zhǎng)至40%可開(kāi)始感染，感染前2h更換5 mL新鮮培養(yǎng)液，并加入10 mg/mL的ULybrene 10 uL，使其在感染時(shí)終濃度為10 ug/mL，然后各取5 mL病毒毒液，室溫慢融，加入BEL-7402細(xì)胞培養(yǎng)液中，輕搖混勻感染細(xì)胞，感染后12 h更換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24—48 h，待細(xì)胞生長(zhǎng)恢復(fù)，加入終濃度為lg/mL的嘌呤霉素進(jìn)行篩選，篩選時(shí)問(wèn)為48 h。將篩選細(xì)胞凍存或繼續(xù)培養(yǎng)以待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。
1.6 Western印跡分析
收集篩選后的細(xì)胞，用RIPA蛋白裂解液裂解，收集蛋白，加入5xSDS，沸水浴8 min后行10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，將凝膠放入轉(zhuǎn)膜儀使蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜，以5%脫脂奶粉室溫封閉30 min，4℃孵育一抗過(guò)夜，或孵育更長(zhǎng)時(shí)間，然后用TBST洗膜液洗膜3次，每次5 min，室溫孵育二抗2～4 h，TBST洗膜3次，每次5 min，滴加化學(xué)發(fā)光液，暗室膠片顯影。
1.7 CCK8檢測(cè)細(xì)胞增殖
將過(guò)表達(dá)和敲低SGK3的肝癌細(xì)胞及其分別的空白對(duì)照培養(yǎng)后以700／孔的密度接種至96孔板中，培養(yǎng)至第0、2、4、7d分別更換為含100 uL 10%CCK8的培養(yǎng)液，37C孵育2.5 h后檢測(cè)D…。值，記錄結(jié)果，校正后繪制CCK8生長(zhǎng)曲線(xiàn)。
1.8激素去除的細(xì)胞系抗凋亡實(shí)驗(yàn)
將FBS用葡聚糖和活性炭處理，制備去甾體激素血清，將細(xì)胞培養(yǎng)在60 cm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至30%—40%，分別在培養(yǎng)皿中更換新鮮的含10%CSS的DMEM培養(yǎng)液以及含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液，4d后收集細(xì)胞，Western印跡檢測(cè)C-PARP。
2結(jié)果
2.1 pCDH-SGK3重組慢病毒載體的構(gòu)建
以實(shí)驗(yàn)室保存的SGK3質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增SGK3編碼序列，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定獲得約1500 bp的條帶，與SGK3編碼序列全長(zhǎng)(1496 bp)一致（圖1）。切取膠塊用膠回收試劑盒回收，用BamH I和NotI對(duì)片段與載體pCDH進(jìn)行雙酶切，回收后將片段和載體用T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，涂板培養(yǎng)后挑菌行PCR菌液鑒定，將陽(yáng)性菌液送公司測(cè)序。經(jīng)對(duì)比，插入片段序列與SGK3基因的編碼序列完全一致。
2.2 BEL-7402-SGK3穩(wěn)定細(xì)胞系的Western印跡
將構(gòu)建的質(zhì)粒pCDH-SGK3和空白質(zhì)粒pCDH-NC分別與慢病毒包裝載體共轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞，制作并收集慢病毒毒液，使用其感染BEL-7402細(xì)胞，經(jīng)過(guò)藥物篩選，獲得穩(wěn)定表達(dá)SGK3的BEL-7402肝癌細(xì)胞系。培養(yǎng)該肝癌細(xì)胞系，提取蛋白行SDS-PAGE，Western印跡檢測(cè)表明SGK3在所構(gòu)建細(xì)胞系中得到表達(dá)（圖2）。
2.3過(guò)表達(dá)SGK3促進(jìn)BEL-7402細(xì)胞的生長(zhǎng)
研究表明，SGK3可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)，因此我們將構(gòu)建的穩(wěn)定過(guò)表達(dá)SGK3的細(xì)胞與其空白對(duì)照接種于96孔板，以第0、2、4、7d作為觀(guān)察點(diǎn)，檢測(cè)D，～值，校正后用GraphPad繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)，經(jīng)SPSS13.0軟件做統(tǒng)計(jì)處理后的結(jié)果如圖3，可發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)SGK3的BEL-7402肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)比空白對(duì)照增快。
2.4 BEL-7402細(xì)胞中雄激素受體的檢測(cè)
提取BEL- 7402細(xì)胞的蛋白，SDS-PAGE后行Western印跡檢測(cè)，同時(shí)以等量（上樣量為50 p-,g）的C4-2細(xì)胞蛋白為對(duì)照，檢測(cè)雄激素受體在BEL-7402細(xì)胞中的表達(dá)。結(jié)果如圖4，用雄激素受體抗體能在相對(duì)分子質(zhì)量約110Xl03處檢測(cè)到特異條帶，說(shuō)明BEL-7402肝癌細(xì)胞中有雄激素受體的表達(dá)。
2.5 CCk-8檢測(cè)BEL-7402細(xì)胞在去甾體激素FBS中的生長(zhǎng)。
將正常BEL-7402肝癌細(xì)胞接種在96孔板中，用完全培養(yǎng)液以及含10% CSS的培養(yǎng)液分別培養(yǎng)，用CCK-8檢測(cè)培養(yǎng)第0、2、4、7d的生長(zhǎng)情況。用酶標(biāo)儀檢測(cè)D，，。。。值，校正后使用GraphPad繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)。結(jié)果如圖5，細(xì)胞在去激素血清中的生長(zhǎng)速度較完全培養(yǎng)液培養(yǎng)的細(xì)胞減慢。
2.6過(guò)表達(dá)SGK3促進(jìn)BEL-7402細(xì)胞在去甾體激素FBS中的抗凋亡能力
用完全培養(yǎng)液與含10% CSS的培養(yǎng)液培養(yǎng)過(guò)表達(dá)SGK3的肝癌細(xì)胞系及其空白對(duì)照，4d后收集培養(yǎng)液（包含上清死亡細(xì)胞）與細(xì)胞，離心后用RIPA裂解液裂解細(xì)胞沉淀，收取蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE和Western印跡檢測(cè)，使用C-PARP抗體檢測(cè)細(xì)胞凋亡，同時(shí)用/-tubulin作為對(duì)照。結(jié)果如圖6，完全培養(yǎng)液中的肝癌細(xì)胞幾乎沒(méi)有C- PARP條帶，而用CSS培養(yǎng)液培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞中C- PARP含量明顯少于其空白對(duì)照。
3討論
SGK3是屬于AGC家族的絲氨酸／蘇氨酸激酶。SGK家族有SGK1、SGK2、SGK3共3個(gè)同源異構(gòu)體，三者基因分布在不同的染色體上，SGK3編碼基因位于8號(hào)染色體長(zhǎng)臂。SGK3處于磷脂酰肌醇-3羥基激酶( PI3K)下游，受PDK1等的調(diào)控。有報(bào)道SGK3也參與IL-3依賴(lài)的存活通路，目前已知其與多種分子作用，包括調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、遷移、生存的效應(yīng)器AIP4f、Fox03a、FLIII、GSK3B、BAD、NDRGI等，調(diào)節(jié)離子通道的NeDD4-2、KCNQl/KCNE、KUL.3、Kir2.1、HERG、GluRl等，此外還有很多。SGK3分子結(jié)構(gòu)包括N端的Phox-ho-mology域（PX域）、中間的激酶區(qū)域和C端的疏水模體。Wang等認(rèn)為SGK3在乳腺癌細(xì)胞中受雌激素水平影響，在前列腺細(xì)胞中同樣受雄激素調(diào)控，改變細(xì)胞的生長(zhǎng)、存活情況。Liu等發(fā)現(xiàn)SGK3在肝癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)，并日．伴隨著糟糕的總生存率。
一項(xiàng)研究中的年齡標(biāo)準(zhǔn)化發(fā)病率結(jié)果顯示，全球肝細(xì)胞癌發(fā)病率在男性中高于女性。除地域等因素外，該比值為2：1—4：1。而在大鼠的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，性別的差異更明顯。部分乙肝陽(yáng)性的患者報(bào)告中，這一比率可高達(dá)7：1。臨床資料顯示，這種發(fā)病率高峰還出現(xiàn)在絕經(jīng)后女性病人中。原發(fā)性肝細(xì)胞癌中這種性別的差異，揭示著性激素及其受體可能參與了肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展。有研究證明，雄激素可以刺激和促進(jìn)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)，在雙氫睪酮(DHT)作用下，肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性關(guān)系。此外，在多數(shù)肝癌和周邊組織中都可以檢測(cè)到雄激素受體，雄激素受體陽(yáng)性伴隨著更高的癌癥復(fù)發(fā)率和糟糕的預(yù)后。雄激素及其受體參與肝癌細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展，可能與其參與的TGF-B1的上調(diào)、p53的抑制、B1整合素的上調(diào)、PI3 K/AK'r通路的激活、CCCRK(cell cycle-related kinase)的上調(diào)、3-catenin/TCF信號(hào)的激活、VEGF/Stat3信號(hào)通路的激活、轉(zhuǎn)移促進(jìn)基因ID1的激活等相關(guān)，在乙肝患者中，雄激素的激活效應(yīng)可以被HBx蛋白放大�，F(xiàn)有證據(jù)充分說(shuō)明雄激素受體在肝癌細(xì)胞中的促進(jìn)作用。
經(jīng)活性炭一葡聚糖處理，可去除血清中的甾體類(lèi)激素，如雄激素、雌激素、甲狀腺激素等，該方法廣泛用于探究前列腺癌細(xì)胞與雄激素及其受體關(guān)系的試驗(yàn)中。本實(shí)驗(yàn)中用Western印跡檢測(cè)到BEL- 7402細(xì)胞株中有雄激素受體的表達(dá)，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)雌激素受體的表達(dá)（數(shù)據(jù)略），實(shí)驗(yàn)中證實(shí)BEL-7402肝癌細(xì)胞在去甾體激素的血清中生長(zhǎng)受到抑制。
多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶(uLy ADP-riboseuLumerase，PARP)的相對(duì)分子質(zhì)量為l16xl03，參與DNA的損傷修復(fù)和細(xì)胞程序性死亡，在體內(nèi)是Cas-pase-3的主要裂解靶向蛋白之一。PARP的裂解(cleavage of PARP)促進(jìn)細(xì)胞崩解并可以作為細(xì)胞凋亡的標(biāo)記物。實(shí)驗(yàn)中BEL-7402細(xì)胞在去甾體激素FBS中培養(yǎng)4d后C-PARP含量明顯增高，說(shuō)明伴隨著明顯的細(xì)胞凋亡。而過(guò)表達(dá)SGK3的BEL-7402肝癌細(xì)胞在去甾體激素FBS中C-PARP含量較過(guò)表達(dá)空質(zhì)粒的空白對(duì)照組明顯減少，說(shuō)明過(guò)表達(dá)SGK3的BEL-7402細(xì)胞可以抵抗其在去甾體激素FBS中的凋亡。
我們的實(shí)驗(yàn)完成了穩(wěn)定過(guò)表達(dá)SGK3的BEL-7402肝癌細(xì)胞系的建立，證實(shí)BEL-7402肝癌細(xì)胞在去甾體激素的血清中生長(zhǎng)受到抑制，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)SGK3的BEL-7402肝癌細(xì)胞在去甾體激素血清培養(yǎng)條件下具有抗凋亡能力。這為今后深入探討肝細(xì)胞癌以及相關(guān)腫瘤的臨床治療提供了一定的基礎(chǔ)。
