構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)轉(zhuǎn)錄輔助因子LBH的人間充質(zhì)干細(xì)胞株
相關(guān)鏈接： 中國(guó)安全網(wǎng) 中國(guó)質(zhì)量網(wǎng) 中國(guó)論文網(wǎng) 中國(guó)資訊網(wǎng)
牛琳，段永娟，王文天，楊洋，趙慧娟，胡曉
中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院血液學(xué)研究所血液病醫(yī)院，實(shí)驗(yàn)血液學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300020
——
[摘要]目的：構(gòu)建轉(zhuǎn)錄輔助因子LBH(limb-bud and heart)過表達(dá)的人間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)株，研究Lbh基因?qū)θ薓SC功能的調(diào)控。方法：通過分子克隆的方法構(gòu)建人Lbh基因的慢病毒表達(dá)質(zhì)粒pCDHP-/bh，經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切和核酸測(cè)序鑒定，利用293T細(xì)胞包裝表達(dá)Lbh基因的慢病毒及對(duì)照；將包裝的病毒感染人MSC，利用表達(dá)載體攜帶的GFP報(bào)告基因，采用流式細(xì)胞術(shù)分選GFP陽(yáng)性目的細(xì)胞；通過油紅0染色鑒定陽(yáng)性細(xì)胞的成脂分化能力，通過茜素紅和硝酸銀染色鑒定陽(yáng)性細(xì)胞的成骨分化能力。結(jié)果：雙酶切和測(cè)序結(jié)果表明正確克隆了人Lbh基因的全長(zhǎng)CDS序列，定量PCR和Western印跡結(jié)果表明構(gòu)建的pCDHP-/bh重組質(zhì)粒能夠表達(dá)Lbh基因；流式分選獲得LBH穩(wěn)定表達(dá)的人MSC細(xì)胞株，該細(xì)胞株經(jīng)成骨和成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)后，油紅0染色、茜素紅染色和硝酸銀染色結(jié)果均呈陽(yáng)性。結(jié)論：構(gòu)建了人Lbh基因的慢病毒表達(dá)質(zhì)粒pCDHP-/bh，并獲得穩(wěn)定表達(dá)Lbh基因的人MSC細(xì)胞株，該細(xì)胞株保留了向脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞定向分化的能力。本研究為迸一步探討Lbh基因?qū)θ薓SC功能的調(diào)控提供了重要的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
[關(guān)鍵詞] limb-bud and heart；轉(zhuǎn)錄輔助因子；人間充質(zhì)干細(xì)胞；慢病毒載體
LBH(limb-bud and heart)是一種轉(zhuǎn)錄輔助因子，其基因?qū)儆谛蛄懈叨缺Ｊ氐木幋a基因，在胚胎肢體和心臟發(fā)育中具有時(shí)空表達(dá)特異性。研究指出，LBH對(duì)肢體、心臟和軟骨內(nèi)成骨發(fā)育過程具有重要影響。在軟骨成骨分化過程中，LBH可能通過抑制Runx2和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的表達(dá)而負(fù)調(diào)控部分血管浸潤(rùn)和早期骨化中心的形成。因此，LBH在成軟骨發(fā)育過程中起著重要的作用。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell，MSC)來源于胚胎發(fā)生期的中胚層，在體內(nèi)和體外具有分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等潛力。同時(shí)，MSC可進(jìn)行有效的體外擴(kuò)增，可誘導(dǎo)分化為多種組織細(xì)胞，特別是中胚層和外胚層的組織細(xì)胞，是一種具有多分化潛能及自我復(fù)制功能的早期未分化細(xì)胞。目前，Lbh基因?qū)SC功能的影響未見研究報(bào)道。在本研究中，我們構(gòu)建了pCDHP-/bh重組質(zhì)粒，在MSC中對(duì)其進(jìn)行穩(wěn)定表達(dá)，并初步探討其對(duì)MSC向成脂成骨分化能力的影響。
1 材料與方法
1.1材料
MSC由本室分離并保存；293T細(xì)胞購(gòu)自ATCC，由實(shí)驗(yàn)血液學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供；pCDHP載體由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建；限制性內(nèi)切酶購(gòu)自NEB公司；dNTP和Taq DNA聚合酶購(gòu)白TaKaRa公司；快速連接試劑盒購(gòu)自Thermo Scientific公司；中量質(zhì)粒提取試劑盒和3- actin抗體（兔源）購(gòu)自康為世紀(jì)公司；Lipo-fectAMINE 2000、TRIzol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PlatinumSYBR Green qPCR SuperMix-UDG和瓊脂糖購(gòu)自Invitrogen公司；LBH抗體（兔源）購(gòu)自Abcam公司；二抗（鼠抗兔）購(gòu)自Jackson公司；DMEM/F12培養(yǎng)基、低糖DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)購(gòu)自Gibco公司；油紅O(oil red O)、茜素紅(alizarin red)和硝酸銀(von Kossa)購(gòu)自Sigma公司。
1.2 pCDHP-/bh重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定
根據(jù)人Lbh序列設(shè)計(jì)上游引物(5，-CGACTATCTGAGATCGGCCA- 3')和下游引物（5 ’一GTCCTTCA GTTTGCAGCAGC-3'），并在上、下游引物的5 ’端分別添加Xba I、Not I酶切位點(diǎn)。以K562細(xì)胞cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增（反應(yīng)條件：940C1 min，以94。C 71 s、65C 39 s、72。Clmin進(jìn)行39個(gè)循環(huán)，72C5 min)。
將PCR產(chǎn)物行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，條帶位置正確且產(chǎn)物特異后，用限制性內(nèi)切酶Xba I、NotI酶切，酶切后的產(chǎn)物與pCDHP載體連接，連接產(chǎn)物經(jīng)轉(zhuǎn)化及克隆擴(kuò)大培養(yǎng)后中量提取質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶Xba I、Not I酶切鑒定并測(cè)序。
1.3慢病毒的包裝
將293T細(xì)胞接種于10 cm皿中，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)70%—80%時(shí)，將慢病毒包裝系統(tǒng)中的pLPl、pLP2、pLP-VSVG和pCDHP-/bh質(zhì)粒按照一定比例混合，加入Opti-MEM混勻；將LipofectAMINE 2000與Op-ti-MEM混勻，室溫孵育5 min；然后將上訴混合液和慢病毒包裝系統(tǒng)混合，室溫孵育20 min后轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48 h后收集含病毒粒子的上清，離心、過濾后置4℃或-80qC保存。
1.4穩(wěn)定表達(dá)LBH的MSC細(xì)胞株的構(gòu)建
將第6代MSC接種于6 cm皿中，加入包裝好的病毒液，同時(shí)加入8 p4g/mL的Polybrene促進(jìn)病毒轉(zhuǎn)染。感染8h后更換新鮮培養(yǎng)基，擴(kuò)大培養(yǎng)后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分選，獲得pCDHP-MSC細(xì)胞和pCDHP-/bh-MSC細(xì)胞。次日于熒光顯微鏡下觀察流式細(xì)胞術(shù)分選后的陽(yáng)性目的細(xì)胞。
1.5 MSC成脂成骨誘導(dǎo)分化及鑒定
取第7代pCDHP- MSC細(xì)胞和pCDHP- Lbh-MSC細(xì)胞接種于12孔板中，加入成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基，并在誘導(dǎo)后的14 d進(jìn)行油紅0染色鑒定誘導(dǎo)效果。油紅0染色：先去除細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS洗3次，10%甲醛室溫固定20 min，用PBS洗3次，加入0.5%油紅0染液，37℃染色30 min，之后用PBS充分洗滌，于40x物鏡的倒置顯微鏡下拍照。
取第7代pCDHP- MSC細(xì)胞和pCDHP- Lbh-MSC細(xì)胞接種于12孔板中，加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，并在誘導(dǎo)后的21 d進(jìn)行茜素紅和硝酸銀染色鑒定誘導(dǎo)效果。茜素紅染色：先去除細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS洗3次，10%甲醛室溫固定20 min，用超純水洗3次，加入0.5%的茜素紅染液，37℃染色10 min，之后用超純水充分洗滌，于40x物鏡的倒置顯微鏡下拍照。硝酸銀染色：先去除細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS洗3次，10%甲醛室溫固定20 min，超純水洗3次，加入5%的硝酸銀染液，37。C染色th，之后用超純水充分洗滌，紫外線照射1～2 h，于40x物鏡的倒置顯微鏡下拍照。
2結(jié)果
2.1 pCDHP-/bh重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定
利用PCR擴(kuò)增人Lbh CDS序列，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在約318 bp位置出現(xiàn)與預(yù)期結(jié)果一致的電泳譜帶（圖1A）；pCDHP-/bh重組質(zhì)粒用Xba I、Not I雙酶切后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，出現(xiàn)8196和318 bp的條帶，符合預(yù)期結(jié)果（圖1A）。將陽(yáng)性克隆測(cè)序，結(jié)果與GenBank庫(kù)中相應(yīng)序列完全匹配，證明擴(kuò)增的Lbh,基因序列沒有發(fā)生突變（圖1B）。在293T細(xì)胞里瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pCDHP-/bh重組質(zhì)粒，72 h后進(jìn)行Western印跡檢測(cè)，結(jié)果表明構(gòu)建的pCDHP-Lbh重組質(zhì)�？梢赃^表達(dá)LBH蛋白（圖1C）。
2.2 LBH穩(wěn)定表達(dá)的MSC細(xì)胞株構(gòu)建
用包裝好的pCDHP-/bh慢病毒感染MSC，96 h后上機(jī)進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分選，獲得GFP陽(yáng)性目的細(xì)胞（圖2A）；在熒光顯微鏡下可觀察到流式細(xì)胞術(shù)分選后的陽(yáng)性目的細(xì)胞有綠色熒光信號(hào)（圖2B）。用定量PCR方法檢測(cè)pCDHP- MSC細(xì)胞和pCDHP-Lbh- MSC細(xì)胞中Lbh基因的表達(dá)水平，結(jié)果顯示pCDHP- Lbh- MSC細(xì)胞中Lbh基因表達(dá)水平比pCDHP-MSC細(xì)胞提高了近85倍（圖2C）。
2.3 MSC的成脂成骨誘導(dǎo)分化及鑒定
將pCDHP-MSC細(xì)胞和pCDHP-/bh-MSC細(xì)胞進(jìn)行成脂誘導(dǎo)分化，分化后14 d進(jìn)行油紅0染色，結(jié)果呈陽(yáng)性，表明pCDHP-/bh.- MSC細(xì)胞株可向脂肪細(xì)胞定向分化（圖3A）。將pCDHP-MSC細(xì)胞和pCDHP-/bh-MSC細(xì)胞進(jìn)行成骨誘導(dǎo)分化，分化后21 d分別進(jìn)行茜素紅染色（圖3B）和硝酸銀染色(圖3C)，結(jié)果呈陽(yáng)性，表明pCDHP-/bh,- MSC細(xì)胞株可向成骨細(xì)胞定向分化。
3討論
2001年，BriegelI c)等首先在小鼠中克隆了Lbh基因。Lbh基囚位于2號(hào)染色體2p23.2，其編碼的LBH蛋白是包含105個(gè)氨基酸殘基的核蛋白，N端為疏水區(qū)，中問含一個(gè)核定位信號(hào)，C端為富含谷氨酸鹽的酸性結(jié)構(gòu)域。2007年，艾建平等首次克隆了人類的Lbh基因，并報(bào)道其位于人染色體2p23區(qū)，基因長(zhǎng)28.5 kb，編碼的人LBH蛋白有105個(gè)氨基酸殘基，預(yù)測(cè)相對(duì)分子質(zhì)量為16.2×103。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，LBH有可能與其他已知基因協(xié)同，在肢體、心臟和軟骨內(nèi)成骨發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。越來越多的研究表明LBH影響著多種疾病的發(fā)生。MSC是一類具有多向分化潛能及自我更新能力的組織干細(xì)胞，是成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞的主要來源。MSC向成骨方向分化能力減弱、向成脂方向分化能力增強(qiáng)是導(dǎo)致老年人發(fā)生骨質(zhì)疏松等疾病的主要原因之一，因此深入研究MSC分化功能及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)是非常必要的。在本研究中我們通過高保真PCR擴(kuò)增/b/z的全長(zhǎng)CDS序列，連接至pCDHP慢病毒表達(dá)載體，構(gòu)建pCDHP-/bh穩(wěn)定表達(dá)重組質(zhì)粒，在293T細(xì)胞中包裝pCDHP-/bh慢病毒并感染MSC，采用流式細(xì)胞術(shù)分選GFP陽(yáng)性目的細(xì)胞，通過油紅0染色證明陽(yáng)性細(xì)胞保留了成脂分化能力，通過茜素紅和硝酸銀染色證明陽(yáng)性細(xì)胞保留了成骨分化能力。
2009年，Conen等報(bào)道軟骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞中過表達(dá)LBH顯著降低了Runx2和VEGF的表達(dá)水平，而LBH過表達(dá)造成的骨發(fā)育障礙能被Runx2的同時(shí)過表達(dá)挽救。2014年，Powder等報(bào)道，LBH通過調(diào)控神經(jīng)嵴細(xì)胞的發(fā)育而影響顱面骨骼形成。1 966年，MSC首先被Friedenstein與Petrakova從大鼠骨髓中分離獲得，且證實(shí)其具有向成骨細(xì)胞分化的潛能。因此，我們構(gòu)建的pCDHP-/bh慢病毒表達(dá)質(zhì)粒及篩選獲得的穩(wěn)定過表達(dá)LBH的MSC，為進(jìn)一步研究/bh基因?qū)SC分化功能的調(diào)控及相關(guān)分子機(jī)制提供了重要的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
