Twistl穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的建立及對(duì)乳腺癌細(xì)胞上皮一間充質(zhì)轉(zhuǎn)變的影響
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宋玉華，陳瀅潔，張亞楠，劉婕，羅曉麗，賈曉蒙，李欣，姜瀟，丁麗華，葉棋濃
1．青島大學(xué)附屬醫(yī)院乳腺中心，山東青島266003；
2．軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所，北京100850
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[摘要]目的：構(gòu)建Twistl的慢病毒真核表達(dá)載體，并建立穩(wěn)定表達(dá)Twistl的乳腺癌細(xì)胞株，研究Twistl在乳腺癌中對(duì)上皮一間充質(zhì)轉(zhuǎn)變(EMT)的影響。方法：以乳腺文庫(kù)為模板，PCR擴(kuò)增Twistl編碼序列，克隆到慢病毒pCDH載體，構(gòu)建成pCDH-Twistl，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，Western印跡鑒定pCDH載體介導(dǎo)的Twistl的表達(dá)；包裝病毒載體，感染ZR75-1細(xì)胞，用嘌呤霉素篩選得到穩(wěn)定表達(dá)Twistl的細(xì)胞株，檢測(cè)ZR75-1細(xì)胞對(duì)EMT的影響。結(jié)果：經(jīng)BamH I、EcoR I雙酶切及測(cè)序證實(shí)得到pCDH-Twistl表達(dá)載體，Western印跡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Twistl在293T細(xì)胞內(nèi)表達(dá)；嘌呤霉素篩選得到穩(wěn)定表達(dá)Twistl的ZR75-I細(xì)胞株。結(jié)論：構(gòu)建了pCDH-Twistl的真核表達(dá)載體并建立了穩(wěn)定表達(dá)Twistl的ZR75-1細(xì)胞，為進(jìn)一步研究Twistl在EMT過程中的機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
[關(guān)鍵詞]Twistl；E-鈣黏蛋白；上皮一間充質(zhì)轉(zhuǎn)變；乳腺癌細(xì)胞
乳腺癌是當(dāng)今嚴(yán)重影響婦女身心健康甚至危及生命的惡性腫瘤，近年來其發(fā)病率逐年上升，并且出現(xiàn)發(fā)病傾向年輕化的趨勢(shì)，給乳腺癌的治療及其預(yù)防提出了新的挑戰(zhàn)。由于它的發(fā)病機(jī)制并未完全闡明，因此探索相關(guān)基因及致病機(jī)制，尋找特異有效的臨床治療靶點(diǎn)是解決問題的關(guān)鍵。隨著人們對(duì)乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的深入研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤上皮細(xì)胞發(fā)生上皮一間充質(zhì)轉(zhuǎn)變( epithelial- to- mesenchymaltransi-tion，EMT)在乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。EMT是研究腫瘤進(jìn)展的重要因素，人類的乳腺癌細(xì)胞經(jīng)過EMT的誘導(dǎo)，可以使其表現(xiàn)出多向分化和自我更新的能力，有利于使腫瘤細(xì)胞脫離原發(fā)灶，獲得侵襲能力，發(fā)生遠(yuǎn)處侵襲和轉(zhuǎn)移。EMT主要以上皮細(xì)胞極性喪失及間質(zhì)極性的獲得為主要特征，表現(xiàn)為間葉細(xì)胞表型標(biāo)志物如N-鈣黏蛋白、波形蛋白、a-平滑肌肌動(dòng)蛋白和細(xì)胞外基質(zhì)膠原蛋白a1、a2等的表達(dá)上調(diào)；上皮細(xì)胞標(biāo)志物如E-鈣黏蛋白、骨架蛋白、連接蛋白、B-連環(huán)素、a-連環(huán)素等表達(dá)下調(diào)；同時(shí)誘導(dǎo)EMT的細(xì)胞因子如Snail、Slug、Twistl及成纖維細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)化細(xì)胞生長(zhǎng)因子的上調(diào)。腫瘤的發(fā)生和發(fā)展的全過程有多種因素共同參與，Twistl作為調(diào)節(jié)EMT過程中的關(guān)鍵因子，對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移，以及腫瘤治療、預(yù)后有非常重要的影響。Twistl的過表達(dá)可以使腫瘤細(xì)胞抗凋亡的能力增強(qiáng)，抑制分化，加速細(xì)胞周期，從而導(dǎo)致腫瘤的轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)。同時(shí)，最新研究發(fā)現(xiàn)，Twistl的過量表達(dá)可以導(dǎo)致E-鈣黏蛋白的表達(dá)減弱甚至喪失，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。為進(jìn)一步研究Twistl的過量表達(dá)在乳腺癌發(fā)生和發(fā)展過程中對(duì)E-鈣黏蛋白表達(dá)的影響，我們從乳腺cDNA文庫(kù)中獲得了Twistl的全長(zhǎng)編碼序列，構(gòu)建了Twistl過表達(dá)的真核表達(dá)載體。人胚腎的293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率高，常用來檢測(cè)真核基因的表達(dá)；慢病毒表達(dá)載體感染效率高，易得到穩(wěn)定克隆。因此，我們將構(gòu)建的pCDH-Twistl真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，檢測(cè)其表達(dá)，并在ZR75-1細(xì)胞中利用慢病毒系統(tǒng)建立了穩(wěn)定表達(dá)Twistl的乳腺癌細(xì)胞。我們的研究為進(jìn)一步檢測(cè)Twistl過量表達(dá)對(duì)乳腺癌細(xì)胞EMT的影響，以及在乳腺癌發(fā)生和發(fā)展中的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
1 材料和方法
1.1材料
293T、ZR75-1細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng)；載體為本實(shí)驗(yàn)室所有；VigoFec由威格拉斯生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；限制性內(nèi)切酶BamH I、EcoR I，LA Taq酶和T。DNA連接酶均購(gòu)自TaKaRa公司；質(zhì)粒提取、膠回收和PCR回收試劑盒為Promega公司產(chǎn)品；DMEM及小牛血清購(gòu)于Gibco公司；PCR引物及測(cè)序由天一輝遠(yuǎn)公司生產(chǎn)完成。
1.2 pCDH-Twistl真核表達(dá)載體的構(gòu)建
根據(jù)GenBank中的Twistl序列(登陸號(hào)為NM_000474)設(shè)計(jì)用于PCR擴(kuò)增的上游引物(5，-CGGGATCCATGATGCAGGACGTGTCCA- 3-)和下游弓I物(5'- CGGAATTCCTAGTGGGACGCGGACAT-3 ’)，以乳腺文庫(kù)為模板，用LA Taq酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增（反應(yīng)條件：95℃變性1 min；95℃變性30 s，58。C復(fù)性30 s，72C延伸50 s，29個(gè)循環(huán)；72。C再延伸7 min），擴(kuò)增片段為608 bp。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)BamH I、EcoR I雙酶切回收Twistl基因，與經(jīng)同樣雙酶切的pCDH表達(dá)載體按一定比例用T。DNA連接酶于16。 C連接8h，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，次日挑取平板上的克隆至500 V,L LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)12 h，經(jīng)菌液PCR鑒定，陽(yáng)性克隆經(jīng)BamH I、EcoR I雙酶切鑒定并測(cè)序。
1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和Western印跡檢測(cè)
將上述構(gòu)建的pCDH-Twistl真核表達(dá)載體和空載體pCDH轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，24 h后收集細(xì)胞，用1×PBS洗2次，3000 r/min離心5 min，棄上清，在細(xì)胞沉淀中加入2～3倍細(xì)胞量的蛋白緩沖液( RIPA)，于冰上裂解30 min，加入2xSDS上樣緩沖液充分混勻，煮沸I5 min，12 000 r/min離心5 min后取上清液進(jìn)行SDS-PAGE(85 V 15 min，130 V 50 min)，電泳結(jié)束后用半干法電轉(zhuǎn)50 min，將蛋白膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，再用TBST配制5%脫脂奶粉封閉1 h或4℃封閉過夜，隨后用5%脫脂奶粉稀釋一抗(GAPDH l:3000，Twistl 1：200) 4C孵育過夜，次日用TBST洗膜3次，每次5—7 min，后加入用5%脫脂牛奶1:5000稀釋的鼠抗1gG抗體，室溫輕搖2h，TBST洗膜3次，每次5 min，將顯影劑A液和B液按1:1混勻并附膜反應(yīng)I5 min后顯影。
1.4穩(wěn)定克隆的篩選
將293T細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞生長(zhǎng)至密度為600/0—70%，將3種包裝質(zhì)粒0.84 p4g pLPl、0.4ht,9 pLP2及0.56 ug VSVG分別與1ug構(gòu)建的重組質(zhì)粒pCDH-Twistl和空質(zhì)粒pCDH混勻后于200 uL無血清無雙抗的DMEM中，分別加入10 pdL Mega-tran轉(zhuǎn)染試劑，渦旋振蕩10 s混勻，室溫靜置10min，后將上述混合物加入接種好的293T細(xì)胞培養(yǎng)基中，4h換液，48 h后收集上清，將上述包好的病毒加入已接種于6孔板的細(xì)胞密度約為70%的ZR75-1細(xì)胞中，每孔約500 uL，24 h后換液，48 h后每孔按照1：1000加入2ug/mL的嘌呤霉素進(jìn)行篩選，按時(shí)觀察，待細(xì)胞死亡較多時(shí)更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，并增加嘌呤霉素用量繼續(xù)篩選，待細(xì)胞數(shù)量不再減少時(shí)即可得到穩(wěn)定的混合克隆。
1.5 Western印跡檢測(cè)pCDH-Twistl對(duì)EMT的影響
將上述篩選的攜帶慢病毒真核表達(dá)載體的ZR75-1細(xì)胞接種于6 cm皿中，待細(xì)胞融合至90%左右時(shí)收集細(xì)胞，用lxPBS洗2次，離心棄上清，加入2xSDS加樣緩沖液，煮沸15 min，離心后取10-15 uL上清蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)束后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂奶粉于4℃封閉1h，然后加入用5%脫脂奶粉稀釋的Twistl(1:200)抗體、E-鈣黏蛋白(1: 200)抗體或GAPDH(I:1000)抗體，4℃封閉過夜，次日用TBST洗膜3次，每次5min，加入用5%脫脂奶粉以1：2000稀釋的鼠抗IgG抗體，室溫輕搖2h，TBST洗膜3次，每次5 min，用化學(xué)發(fā)光法顯色5 min，壓片顯影。
2結(jié)果
2.1 Twistl的PCR擴(kuò)增
以乳腺文庫(kù)為模板，PCR擴(kuò)增Twistl全長(zhǎng)編碼序列，長(zhǎng)度應(yīng)為608 bp，DNA凝膠電泳結(jié)果與預(yù)期大小相符（圖1）。
2.2 pCDH-Twistl載體的構(gòu)建
將PCR擴(kuò)增的Twistl編碼序列和pCDH載體分別經(jīng)BamH I和EcoR I雙酶切處理，經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化，抗性篩選得到的重組質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定為陽(yáng)性（結(jié)果未示）。將鑒定為陽(yáng)性的質(zhì)粒用BamH I和EcoR I雙酶切，在608 bp處可見特異片段，而空載體無此特異條帶（圖2）。以I二結(jié)果表明pCDH-Twistl真核表達(dá)載體構(gòu)建成功。
2.3 pCDH-Twistl在293T細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)鑒定
將L述陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒后轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，對(duì)照組轉(zhuǎn)染pCDH空載體，48 h后收細(xì)胞，Western印跡檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Twistl的表達(dá)，以GAPDH為內(nèi)參，結(jié)果見圖3。轉(zhuǎn)染pCDH-Twis,tl真核表達(dá)載體的細(xì)胞中表達(dá)相對(duì)分子質(zhì)量約25x10'的一條特異性條帶，對(duì)照組明顯減弱，與預(yù)期結(jié)果相符，表明載體攜帶的pCDH-Twistl編碼序列能夠在293T細(xì)胞中過表達(dá)。
2.4建立ZR75-1穩(wěn)定克隆并檢測(cè)對(duì)EMT的影響
收集上述經(jīng)嘌呤霉素篩選的751-pCDH-Twistl及751-pCDH細(xì)胞穩(wěn)定克隆，Western印跡檢測(cè)細(xì)胞pCDH-Twistl對(duì)E-鈣黏蛋白因子的影響，以GAPDH為內(nèi)參。結(jié)果見圖4，E-鈣黏蛋白抗體在細(xì)胞中表達(dá)約相對(duì)分子質(zhì)量約100XIO'的相對(duì)于對(duì)照組減弱的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符，表明pCDH-Twistl載體可以使細(xì)胞中E-鈣黏蛋白的表達(dá)減弱。
2.5 pCDH-Twistl可通過調(diào)節(jié)EMT使細(xì)胞變形獲得遷移和生存。
將上述通過鑒定的751-pCDH-Twistl和751-pCDH穩(wěn)定克隆細(xì)胞株分別傳代至6 cm皿，記錄觀察細(xì)胞形態(tài)的變化。2周時(shí)對(duì)照組細(xì)胞兀明顯變化；751-pCDH-Twistl細(xì)胞株細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，細(xì)胞胞體積略增大，細(xì)胞形態(tài)變得細(xì)長(zhǎng)，呈菱形和三角形，利于細(xì)胞獲得浸潤(rùn)遷移的能力（圖5）。
3討論
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)Twistl在胃癌、乳腺癌、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、食管癌、橫紋肌肉瘤、胰腺癌和結(jié)直腸癌等表達(dá)異常，但對(duì)于Twistl的研究在乳腺癌中更為深入。TWistl的表達(dá)上調(diào)不僅涉及到乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展過程，在乳腺癌的浸潤(rùn)侵襲、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤分期等方面也同樣重要。最早是在細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡中認(rèn)識(shí)到Twistl的作用。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，Twistl基因與EMT現(xiàn)象及腫瘤轉(zhuǎn)移有很大的相關(guān)性。此外，在腫瘤血管生成及耐藥等方面Twistl也都參與其中。Twistl參與了某些上皮來源的腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT并促進(jìn)其侵襲與轉(zhuǎn)移。Twistl可以通過影響腫瘤細(xì)胞的凋亡，抑制分化，從而在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中起重要作用。Twistl的表達(dá)上調(diào)可以導(dǎo)致癌細(xì)胞出現(xiàn)干細(xì)胞樣特性，比如腫瘤球的形成及腫瘤的成管等。Florian等指出，EMT是腫瘤進(jìn)展的重要步驟，Twistl作為胚胎發(fā)育基因參與了EMT的全過程。Twistl作為一種轉(zhuǎn)錄因子可作用于E-鈣黏蛋白上游合成的過程，從而抑制其表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。Twistl過表達(dá)可以使腫瘤細(xì)胞中E-鈣黏蛋白表達(dá)下調(diào)，降低了腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡的概率，從而促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞從原發(fā)部位脫落，侵入周圍組織，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移。最新研究表明，發(fā)育中的EMT顯而易見的特點(diǎn)是誘導(dǎo)細(xì)胞極性紊亂，破壞基底膜，從而增加細(xì)胞的可塑性，使細(xì)胞的遷移能力增強(qiáng)，而這一系列過程均與上皮黏附素E-鈣黏蛋白向神經(jīng)黏附素N-鈣黏蛋白轉(zhuǎn)換有關(guān)。
綜上，我們構(gòu)建了Twistl過表達(dá)的克隆質(zhì)粒pCDH-Twistl，并建立了穩(wěn)定表達(dá)Twistl的乳腺癌細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)Twistl過表達(dá)可以通過調(diào)節(jié)E-鈣黏蛋白表達(dá)使乳腺癌細(xì)胞發(fā)生EMT。這有助于進(jìn)一步探討乳腺癌的治療，同時(shí)為深入研究Twistl過表達(dá)在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制開辟了新的道路，也為臨床分子靶向治療奠定了基礎(chǔ)，為腫瘤患者帶來了新的希望。
