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  張晶，趙興然，張群，李清揚(yáng)，王向紅*

  河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院(保定071000)

摘要建立了動(dòng)物源性食品中常用的頭孢羥氨芐、頭孢氨芐、頭孢噻肟、頭孢拉定和頭孢唑啉5種頭孢類抗生素的高效液相色譜法。樣品經(jīng)乙腈水溶液提取，過固相萃取柱凈化，以磷酸鹽緩沖液與甲醇(80：20)為流動(dòng)相，對5種頭孢類抗生素進(jìn)行了分離測定，5種頭孢類抗生素可在50 min內(nèi)分離，最低檢測限均可達(dá)到10 μg/kg。六種動(dòng)物源性食品中檢測5種藥物的回收率均在70.05%~95.51%之間，精密度為2.72%。該方法簡單、靈敏、可靠，適用于動(dòng)物源性食品中頭孢類抗生素殘留的分析確證。

關(guān)鍵詞  高效液相色譜；頭孢類抗生素；動(dòng)物源性食品

 頭孢菌素是繼青霉素之后在自然界發(fā)現(xiàn)的又一類β一內(nèi)酰胺類抗生素，由于其具有抗菌譜廣、抗菌作用強(qiáng)、臨床療效高、不良反應(yīng)較少等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)及獸醫(yī)臨床上。用其治療動(dòng)物呼吸道感染、細(xì)菌感染等疾病時(shí)，不可避免地引起在動(dòng)物組織及其制品中的殘留，給人類食品安全帶來危害。因此，世界各組織及各國紛紛制定食品中抗生素殘留標(biāo)準(zhǔn)。2001年和2002年，我國農(nóng)業(yè)部又先后公布了“無公害食品生鮮牛乳”( NYIT 5045-2001)、  “無公害食品滅菌乳”（NY 5141-2002）和“無公害食品巴氏殺菌乳”( NY 5140-2002)等行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，規(guī)定了“抗生素不得檢出”。美國FDA針對使用廣泛的頭孢類抗生素發(fā)布部門規(guī)定：從2012年4月5日開始，禁止給牛、豬、火雞使用頭孢類抗生素。韓國2011年的7月1日起，全面禁止動(dòng)物飼料中添加抗生素。然而，為適應(yīng)市場與醫(yī)療的需要，每年都有許多更有效且更廣譜的頭孢菌素被開發(fā)出來。因此，建立該類藥物的分析檢測方法對于食品安全具有重要的意義。

 目前關(guān)于動(dòng)物源性食品中抗生素殘留的檢測方法主要有：微生物檢測法、免疫檢測法、理化檢測方法等。微生物檢測法具有可靠，成本低的優(yōu)點(diǎn)，但存在操作時(shí)間長，過程復(fù)雜，肉眼辨別誤差大等缺點(diǎn)；酶聯(lián)免疫法具有操作簡單、快速的優(yōu)點(diǎn)，但易產(chǎn)生假陽性。理化檢測法中的高效液相色譜法具有靈敏度高、分離效率高、應(yīng)用范圍廣、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于藥物分析。最近幾年，高效液相色譜法應(yīng)用于頭孢類抗生素的檢測，但應(yīng)用高效液相色譜法測定單組分頭孢類抗生素的報(bào)道很多，《中國藥典》也有記載，但是應(yīng)用高效液相色譜法同時(shí)測定幾種頭孢類抗生素的報(bào)道卻很少，藥典也沒有收載。以中國藥典所采用的方法為基礎(chǔ)，建立了在同一種流動(dòng)相同一色譜中分離檢測動(dòng)物源性食品中頭孢羥氨芐、頭孢氨芐、頭孢噻肟、頭孢拉定和頭孢唑啉5種頭孢類抗生素殘留的高效液相色譜法。該法操作簡便快速，靈敏準(zhǔn)確。

1  材料與方法

1.1儀器與設(shè)備

 Agilent 1200型高效液相色譜儀：美國安捷倫有限公司；Agilent C18色譜柱：美國安捷倫有限公司；分析天平BS214D：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司：SK-1型渦旋混勻器：麒麟醫(yī)儀；高速離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-52A：上海亞榮生化儀器廠；離心機(jī)TGL16M：長沙易達(dá)儀器公司；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有

限公司；固相萃取柱：Oasis HLB固相萃取柱，500 mg，6 m L:  Waters公司。

1.2試劑

 頭孢羥氨芐、頭孢氨芐、頭孢噻肟、頭孢拉定和頭孢唑啉（純度均≥99.0%），中國藥品生物制品檢定所；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉（純度≥99.0%）．天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；乙腈、甲醇，為色譜純級；試驗(yàn)用水均為超純水。

1.3標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制

 分別精密稱取5種標(biāo)準(zhǔn)品各0.001 0 g，溶于1 m L甲醇溶液中，超聲混勻，配制成1mg/m L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-20℃保存。然后用甲醇溶液逐步稀釋成適當(dāng)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.4樣品處理

1.4.1樣品的提取

 動(dòng)物肝臟、肌肉組織：稱取4.00 g已粉碎的樣品于50 m L離心管中，加入12 m L乙腈水溶液(15：2．體積比)，均質(zhì)30 s，于4℃4 000 r/min離心5 min,將清液轉(zhuǎn)移至50 m L離心管中；另取-離心管，加入8 m L乙腈水溶液，洗滌均質(zhì)器刀頭；用玻璃棒搗碎離心管中的沉淀，加入上述洗滌均質(zhì)器刀頭的溶液，在渦旋混合器上振蕩1 min，4 000 r/min離心5 min，上清液合并至50 m L離心管中，重復(fù)用8 m L乙腈水溶液洗滌刀頭并提取一次，合并至50 m L離心管中，定容至50 m L，取20 m L人100 m L雞心瓶。

 牛奶：將牛奶樣品置于離心管中，室溫下4 000 r／min離心10 min，棄去脂肪層。稱取4.00 g已脫脂的樣品于50 m L離心管中，加入12 m L乙腈水溶液(15：2，體積比)，均質(zhì)30 s，4 000 r/min離心5 min，清液轉(zhuǎn)移至50 m L離心管中；另取-離心管，加入8 m L乙腈水溶液，洗滌均質(zhì)器刀頭；用玻璃棒搗碎離心管中的沉淀，加入上述洗滌均質(zhì)器刀頭溶液，在渦旋混合器上振蕩1min，4 000 r/min離心5 min，上清液合并至50 m L離心管中，重復(fù)用8 m L乙腈水溶液洗滌刀頭和提取一次，合并至50 m L離心管中，定容至50 m L，取20 m L人100 m L雞心瓶。

1.4.2樣品的凈化

 立即向已經(jīng)除去乙腈的雞心瓶中加入25 m L磷酸鹽緩沖溶液( 0.05 mol/L，pH 8.5)；渦旋混勻1 min，用0.1 mol/m L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH為8.5，以1 m L/min的速度通過經(jīng)過預(yù)處理的固相萃取柱，先用2 m L磷酸鹽緩沖溶液淋洗兩次，再用1 m L超純水淋洗。用3 m L乙腈洗脫（速度控制在1m L/min）。將洗脫液置于雞心瓶中在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上（45℃水�。┱舭l(fā)至除去乙腈。用甲醇定容至1 m L，過0.45μm濾膜，供HPLC分析。

1.4.3色譜條件

 色譜柱：Agilent-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流動(dòng)相：磷酸鹽緩沖液(50 m mol/L)：甲醇( 80：20)；檢測波長：254 nm;柱溫：250C;流速：0.8 m L/min;進(jìn)樣量：10μL 。

1.5標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及最低檢測限

 將1mg/m L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用甲醇稀釋，得到1，2，4，8，16和32 μg/m L系列質(zhì)量濃度的標(biāo)液，依次進(jìn)行HPLC分析。以標(biāo)品濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出回歸方程，并得到相關(guān)系數(shù)。以最低檢出濃度計(jì)算，3倍信噪比( S/N)為最低檢測限(LOD)。

1.6方法的精密度與回收率

 在選定的條件下，連續(xù)7次進(jìn)樣質(zhì)量濃度32 μg/m L的標(biāo)準(zhǔn)品，測定各組分的峰面積，計(jì)算日內(nèi)精密度。在已知提取條件下對生鮮豬肉、牛肉、蝦肉、牛奶、生豬肝和熟豬肝等六種動(dòng)物源性食品為試驗(yàn)材料，進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，加標(biāo)水平分別為10，20和40μg/kg。

2結(jié)果與討論

2.1頭孢類抗生素標(biāo)準(zhǔn)品與空白樣品加標(biāo)色譜圖

 試驗(yàn)以中國藥典所采用的方法為基礎(chǔ)，建立了在同一種流動(dòng)相上同一次色譜中分離檢測頭孢羥氨芐、頭孢氨芐、頭孢噻肟、頭孢拉定和頭孢唑林的高效液相色譜法。圖1為各頭孢類抗生素的標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖。圖2~圖7為頭孢類抗生素在各樣品組織中的加標(biāo)色譜圖。

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線與最低檢出限

 各頭孢類抗生素的線性回歸方程見表1。5種頭孢類抗生素在1～32μg/m L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均在0.997以上。頭孢羥氨芐、頭孢氨芐、頭孢噻肟、頭孢拉定和頭孢唑啉5種頭孢類抗生素的最低檢出限均可達(dá)到10 μg/kg。

2.3方法的精密度和加標(biāo)回收率

在選定的條件下，連續(xù)7次進(jìn)樣質(zhì)量濃度為32 μg/m L的標(biāo)準(zhǔn)品，測定各組分的峰面積，計(jì)算日內(nèi)精密度，RSD為2.72%(n=7)。在已知提取條件下對生鮮豬肉、牛肉、蝦肉、牛奶、生豬肝和熟豬肝進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，表2~表4為各組分的加標(biāo)回收率。由表可知，各組分回收率均在70.05%～95.51%之間，說明樣品前處理方法可行，滿足動(dòng)物性食品中頭孢類抗生素藥物殘留檢測的要求。

3結(jié)論

 建立了分離和檢測5種頭孢類抗生素的高效液相色譜法，在1～32 μg/m L范圍內(nèi)均呈線性關(guān)系，頭孢羥氨芐、頭孢氨芐、頭孢噻肟、頭孢拉定和頭孢唑啉的線性回歸方程分別為：Y=32.425X-9.527 9，Y=23.124X-8.297, Y=34.734X-13.445, Y=16.939X-5.021 9和Y=31.035X-1.629 4，相關(guān)系數(shù)均大于0.997，線性良好，最低檢出限均可達(dá)10 μg/kg，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.72%，5種抗生素在動(dòng)物性食品中的加標(biāo)回收率均在70.05%～95.51%之間。

 該方法樣品處理過程簡單，操作快速，分析方法重復(fù)性好，靈敏度高，精密度及回收率均可滿足實(shí)際工作的要求，可適用于動(dòng)物源性食品中的頭孢菌素類抗生素的定性和定量檢測，能夠滿足各國對上述頭孢菌素類抗生素的最大殘留量要求，具有廣泛的適用性。