磷酸化Aktl (Thr308)位點(diǎn)突變真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其生物學(xué)功能研究
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熊加秀 丁麗華 劉文忠 張亞楠 陳志達(dá) 羅曉麗 賈小萌 陳瀅潔 葉棋濃 衛(wèi)勃
1．內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特010059;
2．軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所，北京100850;
3．解放軍總醫(yī)院普通外科，北京100853；
4．神華神東總醫(yī)院，陜西榆林719315
[摘要]目的：構(gòu)建磷酸化Aktl(Thr308)位點(diǎn)突變真核表達(dá)載體，并瞬時(shí)轉(zhuǎn)染胃癌耐藥細(xì)胞，對其生物學(xué)功能進(jìn)行初步檢測，方法：以帶有pcDNA3．O-Flag標(biāo)簽的Aktl質(zhì)粒為模板，采用重組PCR技術(shù)擴(kuò)增得到Aktl(T308A)（蘇氨酸突變成丙氨酸）、Aktl(T308E)（蘇氨酸突變成谷氨酸）位點(diǎn)突變編碼區(qū)序列，將其插入pcDNA3.0-Flag載體，雙酶切和測序驗(yàn)證后瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人胚腎293rr細(xì)胞，Western印跡檢測其表達(dá)情況；將突變質(zhì)粒與空載體分別轉(zhuǎn)染人胃癌耐藥細(xì)胞BGC-823／(．DDP，通過Western印跡和實(shí)時(shí)定量PCR檢測Notchl蛋白和mRNA水平的變化，通過CCK-8法檢測對耐藥細(xì)胞生長曲線的影響。結(jié)果：雙酶切和測序結(jié)果表明Aktl(T308A)、Aktl( rr308E)的真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后獲得表達(dá)；轉(zhuǎn)染人胃癌耐藥細(xì)胞BGC- 823／cDDP后，利用實(shí)時(shí)定量PCR和Western印還證明去磷酸化Aktl( T308A)可抑制Nolchl的轉(zhuǎn)錄和蛋白水平，模擬持續(xù)磷酸化Aktl(T308E)升高Notchl的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)；細(xì)胞生長曲線結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染Aktl (T308A)較空載體耐藥細(xì)胞生長慢，而Aktl (T308E)促進(jìn)耐藥細(xì)胞生長。結(jié)論：PI3K/Akt與Notchl信號通路的激活在胃癌耐藥的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用？
[關(guān)鍵詞] Aktl；Nocchl；點(diǎn)突變；耐藥；胃癌
Aktl是細(xì)胞編碼的一種相對分子質(zhì)量為57xl03的絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶，又稱蛋白激酶B(PKB)，是磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)IA型最重要的下游分子，在細(xì)胞生長、分化、凋亡，腫瘤轉(zhuǎn)移，血管形成和抵抗化療、放療等方面起重要作用。研究表明，PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路廣泛參與腫瘤耐藥的發(fā)生、發(fā)展M。Jiao等研究發(fā)現(xiàn)化療藥物能通過激活的PI3K/Akt信號通路，提高磷酸化的Akt水平，下調(diào)乳腺癌細(xì)胞對化療藥物的敏感性。Abdul等在MRP1介導(dǎo)的結(jié)腸腺癌耐多柔比星HT29RDB細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)PI3K特異性阻滯劑LY294002可以增加多柔比星的敏感性，發(fā)揮逆轉(zhuǎn)耐藥作用。LY294002還可以抑制耐藥細(xì)胞中Notchl蛋白表達(dá)。最近研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt/mTOR信號通路的激活與Notchl蛋白關(guān)系密切。Hales等已證實(shí)Notchl還可以通過Aktl( Thr308)下游基因PP2A使Thr308去磷酸化。Noichl調(diào)控上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞形成，導(dǎo)致腫瘤抵抗化療藥物治療，可作為腫瘤耐藥的分子機(jī)制。
目前，關(guān)于PI3 K/Akt與Notchl信號通路的激活調(diào)控胃癌耐藥的機(jī)制尚不明確。我們將磷酸化Aktl( Thr308)位點(diǎn)進(jìn)行點(diǎn)突變后克隆至pcDNA3.O-Flag真核表達(dá)載體，檢測磷酸化Aktl( Thr308)位點(diǎn)突變在胃癌耐藥細(xì)胞中的生物學(xué)功能及其對Notchl蛋白的影響，為研究PI3 K/Akt與Notchl信號傳導(dǎo)通路的激活影響胃癌耐藥的發(fā)生、發(fā)展奠定基礎(chǔ)。
1 材料與方法
1.1材料
人胃癌耐藥細(xì)胞BGC-823/cDDP、人胚腎293T細(xì)胞、大腸桿菌DH5a均由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所保存并傳代培養(yǎng)；pcDNA3.0- Flag- Aktl、pcDNA3.O-Flag載體為本室保存；DMEM培養(yǎng)基購自GIBCO公司；新生牛血清由浙江天杭生物科技有限公司生產(chǎn)；高效真核轉(zhuǎn)染試劑盒Lip02000購自上�；鄯f生物技術(shù)有限公司；BamH I和EcoR I限制性核酸內(nèi)切酶、高保真pflL DNA聚合酶、T3DNA連接酶、PCR試劑均購白TaKaRa公司；質(zhì)粒提取、膠回收純化、PCR和酶切產(chǎn)物回收試劑盒為Promega公司產(chǎn)品；HRP標(biāo)記的Flag抗體購白Sigma公司；兔抗人Akt、p-Akt308、Notchl、Hesl抗體購自Abcam公司；兔抗人GAPDH購白Santa Cruz公司；Western印跡發(fā)光檢測試劑盒為威格拉斯生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；引物由北京賽百盛生物技術(shù)有限公司合成；測序由北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司完成。
1.2 Aktl(T308A)、Aktl (T308E)位點(diǎn)突變編碼區(qū)序列的擴(kuò)增
根據(jù)NCBI公布的Aktl的cDNA編碼區(qū)(CDS)全長序列，設(shè)計(jì)引物（表1），PCR擴(kuò)增Aktl( Thr308)位點(diǎn)突變的CDS序列。擴(kuò)增條件：95C預(yù)變性5min；95℃變性30 s，580C退火30 s，72CC延伸2 min，30個(gè)循環(huán)；72C再延長7 min。使用高保真pfu DNA聚合酶。
1.3 Aktl(T308A)、Aktl( T308E)位點(diǎn)突變質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定
將PCR產(chǎn)物行13 g/L瓊脂糖凝膠電泳，若條帶特異且位置正確，則膠回收PCR產(chǎn)物，用BamH I和EcoR I雙酶切，形成帶粘性末端的雙鏈，與經(jīng)同樣雙酶切的pcDNA3.O-Flag載體用T4DNA連接酶連接，取連接產(chǎn)物7.5 pdL轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)，隨后挑克隆于5 mL LB培養(yǎng)基（含氨芐西林）中，370C振蕩培養(yǎng)4～6 h，菌液PCR篩選陽性克隆，振蕩培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，再用BamH I和EcoR I雙酶切鑒定，將鑒定正確的克隆送北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司測序。
1.4質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞
用含1%雙抗及10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基將人胚腎293T細(xì)胞接種于6孔板中，接種量以轉(zhuǎn)染時(shí)70%～80%的細(xì)胞密度為宜，轉(zhuǎn)染前l(fā) h換液。將4uL Lip02000與200 uL NaCl混合，靜置5 min，期間將5 ug質(zhì)粒與200 uL NaCl混合，然后將上述2種溶液混勻，室溫靜置15 min后加入6孔板中；以同種方法轉(zhuǎn)染pcDNA3.O-Flag載體作為對照。370C、5% C02常規(guī)培養(yǎng)，4—6 h后換新鮮DMEM培養(yǎng)基，24—48 h后收細(xì)胞。
1.5Western印跡檢測
細(xì)胞轉(zhuǎn)染24—48 h后收集細(xì)胞總蛋白。用1×PBS洗1次，3000 r/min離心5 min，棄上清，在細(xì)胞沉淀中加入2—3倍細(xì)胞量的蛋白緩沖液( RIPA)，于冰上裂解30 min，并加入2xSDS上樣緩沖液混勻，煮沸10～15 min，12 000 r/min離心2 min，取上清液進(jìn)行SDS-PAGE，電泳結(jié)束后用半干法電轉(zhuǎn)1 h，將蛋白膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，再將硝酸纖維素膜用TBST配制的5010脫脂奶粉封閉th或4℃封閉過夜，隨后用5%脫脂奶粉稀釋的一抗( GAPDH1:1000, p- Akt308、Notchl、Hesl l:500)孵育，室溫下在搖床上輕搖1—2 h或4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次5～7 min，加入用5%脫脂奶粉稀釋的相應(yīng)二抗(1: 3000)（若一抗用HRP標(biāo)記，無需二抗），室溫輕搖孵育1 h，TBST洗膜3次，每次5~7 min，最后用化學(xué)發(fā)光法顯色5 min，壓片顯影。
1.6 RNA提取及實(shí)時(shí)定量PCR
取6 cm皿里融合度為100%的細(xì)胞，棄培養(yǎng)基，用lxPBS洗滌，用500 V,L TRIzol溶液吹下細(xì)胞，室溫靜置5 min，加0.2 mL氯仿提取蛋白混勻，室溫靜置2—3 min，4℃、12 000 r/min離心10 min，小心取上清液0.4 mL，加等量異丙醇混勻，- 20。C冷凍10min，4℃、12 000 r/min離心10 min，棄上清，用1mL 75%乙醇（DEPC水稀釋）洗1次，4℃、12 000 r／mm離心5 min，棄上清，用無水乙醇洗1次，高速離心后去上清，自然干燥RNA約30 min，加入20 VLDEPC水溶解沉淀，測吸光度D值定量RNA濃度。
取總RNA 2p4g，與0.5 Vg oligo(dT)隨機(jī)引物混勻，補(bǔ)水至15.9 VL，70CC解鏈5 min，自然冷卻至室溫，加入反轉(zhuǎn)錄酶、dNTP、RNA酶抑制劑及反轉(zhuǎn)錄緩沖液，補(bǔ)水至終體積25 V,L，42。C反應(yīng)th，95℃滅活5 min，得到反轉(zhuǎn)錄的cDNA第一鏈。將得到的cDNA按1：20稀釋，取1uL模板、10yL 2xSYBRl和上、下游引物各0.4 rLL混勻，用RT-PCR儀分別擴(kuò)增Notch1 cDNA（正向引物：5，-TGCCGAACCAATACAACCCTC-3-；反向引物：5／-TGCTAGCTCATCATCTGGGACA-3'）和3-actin內(nèi)參基因引物對照cDNA(正向引物：5，-ATCACCATTGGCAATGAGCG-3-；反向引物：5，- TTGAAGGTAGTTTTCGTGGAT- 3')，所得數(shù)據(jù)按2-AAC1公式計(jì)算出基因表達(dá)的相對量。
1.7 生長曲線實(shí)驗(yàn)
取對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于96孔板中，每孔2000—3000細(xì)胞，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，37。C、5%CO2培養(yǎng)箱孵育，分別在12、24、48、72、96 h時(shí)加入CCK-8（1/10溶于DMEM中），繼續(xù)孵育th后，用酶聯(lián)免疫檢測儀測定D450nn，值，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)、平均D450mn值為縱軸坐標(biāo)繪制細(xì)胞增殖曲線。
2結(jié)果
2.1 pcDNA3.O-Flag-AktI(T308A)、Aktl(T308E)位點(diǎn)突變質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定
以實(shí)驗(yàn)室保存的pcDNA3.0- Flag-Aktl質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增Aktl (T308A)、Aktl (T308E)位點(diǎn)突變的CDS序列，先獲得929、513 bp片段，后重疊連接獲得長約1442 bp的DNA片段，與預(yù)期大小一致（圖1）。將PCR產(chǎn)物用Bam,H I和EcoR I雙酶切后與經(jīng)同樣雙酶切的pcDNA3.O-Flag載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，挑選克隆進(jìn)行菌液PCR鑒定，獲得與目的條帶1442 bp接近（圖2）的克隆，初步認(rèn)為是帶有Aktl(T308)位點(diǎn)突變的陽性克隆。將所得陽性克隆提質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定，可切出2條長度分別約為5000和1442 bp的條帶，而相應(yīng)的空載體酶切只見大片段，符合預(yù)期結(jié)果（圖2）。DNA序列測序結(jié)果表明，插入片段的DNA序列與Aktl( Thr308)位點(diǎn)突變的CDS序列完全一致（圖3）。
2.2 pcDNA3.O-Flag-Aktl(T308A)、Aktl (T308E)位點(diǎn)突變質(zhì)粒表達(dá)效果的檢測
將構(gòu)建的pcDNA3.O-Flag-Aktl (T308A)、Aktl(T308E)位點(diǎn)突變質(zhì)粒和野生型pcDNA3.0- Flag-Aktl質(zhì)粒及pcDNA3.0- Flag空載體分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，24—48 h后提取細(xì)胞蛋白進(jìn)行SDS-PAGE．Western印跡檢測位點(diǎn)突變的表達(dá)。結(jié)果顯示（圖4），轉(zhuǎn)染突變質(zhì)粒后，用Flag-HRP抗體能夠在相對分子質(zhì)量約57xi03處檢測到明顯的特異性條帶，空載體無條帶，說明位點(diǎn)突變真核表達(dá)載體能在293T細(xì)胞中正確表達(dá)。
2.3 磷酸化Aktl (Thr308)位點(diǎn)突變對Notchl轉(zhuǎn)錄和蛋白水平的影響
用高效真核轉(zhuǎn)染試劑Lip02000，將pcDNA3.0-Flag-Aktl、Aktl (T308A)、Aktl (T308E)和空載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人胃癌耐藥細(xì)胞BGC-823/cDDP，采用qRT-PCR和Western印跡檢測耐藥細(xì)胞中Notchl mRNA和蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示（圖5），與轉(zhuǎn)染空載體相比，去磷酸化pcDNA3.O-Flag-Aktl (T308A)明顯下調(diào)Notchl的mRNA水平，而模擬持續(xù)磷酸化pcDNA3.O一Flag-Aktl(T308E)升高Notchl的轉(zhuǎn)錄水平，與野生型pcDNA3.0- Flag- Aktl相比無差異，此實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，圖標(biāo)注的有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同樣，West-ern印跡也驗(yàn)證了Aktl( T308A)去磷酸化后，耐藥細(xì)胞中P-Akt308磷酸化水平下降，Notchl、Hesl蛋白表達(dá)也下降；而持續(xù)磷酸化時(shí)，P-Akt308和Notchl、Hes1蛋r1表達(dá)上調(diào)，與野生型pcDNA3.O-Flag-Aktl的條帶相比灰度兀差異。
2.4 CCK-8法驗(yàn)證磷酸化Aktl (Thr308)位點(diǎn)突變對胃癌順鉑耐藥細(xì)胞的影響
用上述瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pcDNA3.0- Flag- Aktl、Aktl( T308A)、AktI(T308E)和空載體已鑒定表達(dá)的人胃癌耐藥細(xì)胞BGC-823/cDDP，通過CCK-8實(shí)驗(yàn)，得到耐藥細(xì)胞生長曲線（圖6）。培養(yǎng)12 h時(shí)，轉(zhuǎn)染Aktl(T308A)、Aktl( T308E)實(shí)驗(yàn)組與空載體和野生型pcDNA3.0- Flag- Aktl，以及用PI3K特異性抑制劑LY294002(20 pdmol/L)處理的對照組之間無明顯差異；培養(yǎng)24、48、72、96 h后，轉(zhuǎn)染pc:DNA3.0- Flag-Aktl (T308A)實(shí)驗(yàn)組與空載體對照組相比，對耐藥細(xì)胞生長有明顯抑制作用，在不同時(shí)段與LY294002處理對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；轉(zhuǎn)染pcDNA3.O-Flag-Aktl( T308E)實(shí)驗(yàn)組與空載體對照組相比，促進(jìn)耐藥細(xì)胞生長，與野生型pcDNA3.0-Flag-Aktl對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
3討論
耐藥是胃癌化療失敗的最主要因素之一，因其監(jiān)測和逆轉(zhuǎn)機(jī)制復(fù)雜，目前仍不能得到完全解釋和有效解決。研究表明，PI3K/Akt作為信號通路網(wǎng)絡(luò)的中樞環(huán)節(jié)，在胃癌化療耐藥的機(jī)制中扮演著重要角色。Hong等構(gòu)建Aktl siRNA的真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染人胃癌細(xì)胞AGS后明顯抑制AGS細(xì)胞中Aktl的表達(dá)水平，且Bcl-2表達(dá)水平顯著下降、Bax表達(dá)水平上調(diào)，同時(shí)增強(qiáng)了阿霉素、長春新堿和5-FU等化療藥物的敏感性。Yu等研究發(fā)現(xiàn)，PI3K／Akt和MAPK/ERK信號傳導(dǎo)通路的激活，導(dǎo)致p53表達(dá)下調(diào)、c-myc表達(dá)增強(qiáng)，從而下調(diào)胃癌化療藥物依托泊甙的敏感性。Baba等利用MTT法測定化療藥物在76例胃癌組織中的敏感性時(shí)發(fā)現(xiàn)p-Akt與多藥耐藥增加有關(guān)。PI3K/Akt/mTOR信號通路與Notchl信號通路的激活關(guān)系錯(cuò)綜復(fù)雜。Notchl通過調(diào)控腫瘤干細(xì)胞的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致腫瘤耐藥。Yeh等研究發(fā)現(xiàn)，Notchl在胃癌順鉑耐藥細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)。同樣，在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、卵巢癌、宮頸癌等，Notchl也被證實(shí)在順鉑耐藥癌癥患者的細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)。目前，關(guān)于PI3K/Akt與Notchl信號通路的激活調(diào)控胃癌耐藥的機(jī)制尚不明確，因此利用點(diǎn)突變方式分別將磷酸化Thr308位點(diǎn)的蘇氨酸突變成丙氨酸和谷氨酸，使磷酸化Thr308位點(diǎn)失活和模擬持續(xù)磷酸化，可檢測磷酸化Aktl及Notchl蛋白的表達(dá)變化，并探討磷酸化Aktl(Thr308)位點(diǎn)突變在胃癌順鉑耐藥細(xì)胞中的生物學(xué)功能。
我們用Western印跡驗(yàn)證了pcDNA3.0- Flag-Aktl (T308A)、Aktl(T308E)位點(diǎn)突變在細(xì)胞中的表達(dá)，并驗(yàn)證了去磷酸化pcDNA3.0- Flag- Aktl( T308A)下調(diào)了耐藥細(xì)胞BGC- 823/cDDP中p-Akt308磷酸化水平及Notchl、下游Hesl的表達(dá)水平，而模擬持續(xù)磷酸化pcDNA3.0- Flag- Aktl(T308E)增強(qiáng)了耐藥細(xì)胞中p-Akt308磷酸化水平及Notchl、下游Hesl的表達(dá)。說明抑制或增強(qiáng)p-Akt( Thr308)能阻斷或激活耐藥細(xì)胞中p-Akt和Notchl的信號傳遞，可以為逆轉(zhuǎn)胃癌順鉑耐藥提供新的思路。為研究磷酸化Aktl( Thr308)位點(diǎn)突變在胃癌耐藥細(xì)胞中的生物學(xué)功能，我們采用CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測Aktl( Thr308)位點(diǎn)突變對胃癌順鉑耐藥細(xì)胞BGC-823/cDDP的影響，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染去磷酸化pcDNA3.0-Flag- Aktl (T308A)和使用PI3K特異性抑制劑LY294002處理后抑制胃癌順鉑耐藥細(xì)胞增殖，當(dāng)轉(zhuǎn)染模擬持續(xù)磷酸化pcDNA3.O-Flag-Aktl(T308E)時(shí)促進(jìn)耐藥細(xì)胞生長。提示阻斷P13 K/Akt和Notchl信號通路能抑制胃癌順耐藥細(xì)胞的增殖，而信號通路的激活會下降耐藥細(xì)胞對化療藥物的敏感性。
綜上所述，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了去磷酸化pcDNA3.0-Flag-Aktl(T308A)（蘇氨酸突變成丙氨酸）可以有效下調(diào)磷酸化Aktl和Notchl蛋白表達(dá)，阻斷信號通路，從而抑制胃癌順耐藥細(xì)胞的增殖，逆轉(zhuǎn)胃癌順鉑耐藥；模擬持續(xù)磷酸化pcDNA3.0- Flag- Aktl(T308E)（蘇氨酸突變成谷氨酸）使磷酸化Aktl和Notchl表達(dá)上調(diào)，激活信號通路，介導(dǎo)胃癌耐藥，據(jù)此推測PI3K/Akt和Notchl信號傳導(dǎo)通路在胃癌耐藥的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。磷酸化Aktl(Thr308)位點(diǎn)突變質(zhì)粒的構(gòu)建，為后續(xù)研究P13K／Akt和Notchl信號傳導(dǎo)通路的激活影響胃癌耐藥的發(fā)生、發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。
