淺析異養(yǎng)硝化苯酚降解菌的篩選及性能
相關(guān)鏈接： 中國(guó)安全網(wǎng) 中國(guó)質(zhì)量網(wǎng) 中國(guó)論文網(wǎng) 中國(guó)資訊網(wǎng)
作者：鄭曉敏
含酚廢水的處理主要有萃取、吸附、氧化、膜分離及生物降解等技術(shù)，其中生物降解因成本低、污染少而被廣泛采納。研究表明，能降解苯酚的菌屬有：假單胞菌屬、芽孢桿菌屬、酵母菌屬、不動(dòng)桿菌屬等，其中研究最多的是假單胞桿菌屬。
煉油廢水含有烴類、酚類以及NH3 -N等多種污染物，廢水量大，COD含量高，硝化率低，NH3 -N脫除不穩(wěn)定，主要原因是某些有毒有機(jī)物對(duì)自養(yǎng)硝化菌產(chǎn)生了抑制，而異養(yǎng)硝化菌能利用有機(jī)碳源，可消除有機(jī)物的抑制，從而提高硝化效果，達(dá)到同時(shí)脫碳脫氮的目的。筆者從煉油廢水生化處理池的活性污泥中篩選出1株能降解苯酚的異養(yǎng)硝化高效菌，并進(jìn)行了種屬鑒定，考察了溫度、pH、搖床轉(zhuǎn)速及底物質(zhì)量濃度對(duì)菌株生長(zhǎng)及苯酚降解性能的影響，同時(shí)對(duì)NH3-N的去除和NO2 -N的產(chǎn)生進(jìn)行了考察，為含酚的氨氮廢水的脫碳脫氮技術(shù)提供了依據(jù)。
1 實(shí)驗(yàn)材料和方法
1.1材料
活性污泥：取自武漢市某石油化工廠廢水生物處理系統(tǒng)；LB培養(yǎng)基：酵母浸出粉5g/L，氯化鈉10 g/L，蛋白胨10 g/L，自然pH；異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基：(NH4)2SO4 1.0 g/L, Na2HPO4·12H2O 7.9 g/L,KH2PO4 1.5 g/L, MgSO4 0.1 g/L, FeSO4·7H2O0. 01 g/L，微量元素儲(chǔ)備液2 m L，pH=7.0；微量元素儲(chǔ)備液：ZnSO4·7H2O 0.12 g/L，MnSO4.H2O0.1 g/L,H3BO3 0.07 g/L,Na2MoO4，H2O 0.04 g/L,CoCl2 0.04 g/L,CuSO4·5H2O 0.02 g/L,p H=8.0。培養(yǎng)基均需在0.1 M Pa、121.5℃條件下滅菌20~30 min,FeSO4．7H2O采用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，苯酚為易揮發(fā)性試劑，在培養(yǎng)基滅菌并冷卻后再加入。
1.2實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1 菌株富集及篩選
將新鮮的活性污泥在LB培養(yǎng)基中活化2次后，轉(zhuǎn)接至含有苯酚的異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基中進(jìn)行馴化，馴化時(shí)p（苯酚）從200～1 000 mg/L梯度增加，之后采用稀釋涂平板和平板劃線的方法得到若干株能降解苯酚的異養(yǎng)硝化菌；對(duì)各菌株進(jìn)行苯酚降解及硝化性能測(cè)試，將性能最好的1株保種，并進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
1.2.2菌種鑒定
菌株形態(tài)學(xué)的觀察和生理生化試驗(yàn)依據(jù)《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》進(jìn)行；DNA提取、PCR產(chǎn)物純化使用試劑盒完成；16S rD NA測(cè)序分析委托武漢擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行。
1.2.3 菌株生長(zhǎng)及苯酚降解條件的選擇
在異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基中將菌株活化至對(duì)數(shù)期，按接種量φ ( A)=3%接種至以苯酚為唯一碳源、NH3-N為唯一氮源的異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基中，p（苯酚）= 600 mg/L，分別考察培養(yǎng)溫度、初始pH、搖床轉(zhuǎn)速及底物質(zhì)量濃度對(duì)菌株生長(zhǎng)及苯酚降解性能的影響。
1.2.4 菌株同時(shí)脫碳脫氮、同步硝化反硝化能力的研究
將活化后的種子液接種至苯酚質(zhì)量濃度分別為600 mg/L和800 mg/L的異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基中，定期取樣測(cè)OD600苯酚、NH3 -N及NO2 -N的質(zhì)量濃度，考察菌株Y10同時(shí)脫碳脫氮及同步硝化反硝化的能力。
1.3分析方法
采用4-氨基安替比林法測(cè)定苯酚的質(zhì)量濃度；采用納氏試劑法測(cè)定NH4+ -N質(zhì)量濃度；
采用N-(1-萘基)-乙二胺光度法測(cè)定NO2 -N質(zhì)量濃度；采用比濁法測(cè)定菌體濃度。
2結(jié)果與討論
2.1菌種鑒定
經(jīng)分離純化獲得19株能降解苯酚的異養(yǎng)硝化菌，選取硝化和苯酚降解性能最好的一株命名為Y10。Y10的菌落形態(tài)及革蘭氏染色后的照片如圖1所示。由圖1可以看出，菌落呈圓形，乳白色，隆起，邊緣整齊，表面光滑，有熒光色素產(chǎn)生，革蘭氏染色呈陰性。生理生化試驗(yàn)結(jié)果表明：淀粉水解試驗(yàn)、糖酵解試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)呈陽(yáng)性，而V -P試驗(yàn)、吲試驗(yàn)呈陰性。
將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的堿基序列輸入到GenBank中進(jìn)行Blast比對(duì)，與Y10同源性較高的部分菌株如表1所示。從表1中可以看出，與Y10同源性達(dá)99%以上的均為假單胞菌屬（Pseudomonas sp.），結(jié)合其形態(tài)學(xué)及生理學(xué)特征，將其鑒定為假單胞菌屬。
2.2 Y10生長(zhǎng)及苯酚降解培養(yǎng)條件的選擇
2.2.1 培養(yǎng)溫度的選擇
在培養(yǎng)基pH =7.0，搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min條件下，培養(yǎng)溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)及苯酚降解的影響如圖2所示。由圖2可見(jiàn)，當(dāng)培養(yǎng)溫度低于25℃時(shí)，菌株生長(zhǎng)及苯酚降解均比較緩慢；當(dāng)溫度高于30℃時(shí)，苯酚去除效果明顯加強(qiáng)，且30、35、40℃條件下菌株的生長(zhǎng)及苯酚降解效果相當(dāng)，8h的降解率均達(dá)100%，因而適宜Y10生長(zhǎng)及苯酚降解的溫度為30~ 40℃。
2.2.2初始pH的選擇
在溫度為35℃，搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min條件下，培養(yǎng)基初始pH對(duì)菌株生長(zhǎng)及苯酚降解的影響如圖3所示。從圖3可以看出，Y10對(duì)培養(yǎng)基pH適應(yīng)范圍較廣，pH=6.0~10.0，菌株培養(yǎng)至7.5 h時(shí)，苯酚均被完全降解；pH=7.0~9.0條件下，菌株Y10的生長(zhǎng)曲線和苯酚降解曲線幾乎各自重合，且較其他條件都好，說(shuō)明中性及偏堿性環(huán)境更利于Y10的生
長(zhǎng)及代謝。
2.2.3搖床轉(zhuǎn)速的選擇
溶解氧是影響好氧微生物生長(zhǎng)及代謝的重要因素，在35℃、pH=9.0條件下，不同搖床轉(zhuǎn)速對(duì)菌體生長(zhǎng)及苯酚降解的影響如圖4所示。由圖4可以看出，菌株生長(zhǎng)與苯酚降解呈正相關(guān)，生長(zhǎng)速率快所對(duì)應(yīng)的苯酚降解率高；當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min時(shí)，Y10生長(zhǎng)和苯酚降解效果為最佳，在7h時(shí)對(duì)600 mg/L苯酚的降解率為100%。
2.2.4底物質(zhì)量濃度的影響
將Y10接種于pH=9.0的異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基中，在35℃、200 r/min條件下，不同底物質(zhì)量濃度對(duì)菌體生長(zhǎng)及苯酚降解的影響如圖4所示。從圖4可以看出，在低質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，OD600隨苯酚質(zhì)量濃度的增加而迅速增大，同時(shí)苯酚質(zhì)量濃度越低，完全降解所需的時(shí)間越短。當(dāng)質(zhì)量濃度≤1 300 mg/L時(shí)，苯酚均能被完全降解，降解能力遠(yuǎn)高于大部分已發(fā)現(xiàn)的苯酚降解菌；當(dāng)質(zhì)量濃度≥1 500 mg/L時(shí)，菌體停止生長(zhǎng)，說(shuō)明高質(zhì)量濃度的苯酚對(duì)菌株的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制，且培養(yǎng)基中苯酚未揮發(fā)，說(shuō)明底物的降解都是因微生物的代謝作用所引起。
2.2.5 菌株脫碳脫氮及同步硝化反硝化性能研究
將Y10接種于p（苯酚）=600 mg/L、p (NH3 -N)=111 mg/L異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基中，在最佳培養(yǎng)條件下，苯酚及NH3-N降解、NO2- -N產(chǎn)生及菌株生長(zhǎng)曲線如圖5(a)所示。從圖5(a)中可以看出，在碳源充足的情況下，菌株生長(zhǎng)與氨氮、苯酚降解同步，6h苯酚降為零時(shí)，NH3 -N降解率為46.8%，繼續(xù)培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)碳源不足時(shí)，菌株生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期，同時(shí)NH3 -N質(zhì)量濃度開(kāi)始反增。
除p（苯酚）=837 mg/L、p（NH3 -N）=114 mg/L外，圖5(b)的其他條件同圖5(a)。待培養(yǎng)基中苯酚降解完后，以相同的m(C)：m(N)向其中分別補(bǔ)加苯酚576.6、110.9 mg/L。對(duì)比圖5(a)、圖5(b)可以看出，當(dāng)碳源充足時(shí)，菌株將持續(xù)生長(zhǎng)，同時(shí)NH3-N也不斷降解，12 h時(shí)被完全降解。圖(a)、圖5(b)中，檢測(cè)到的NO2 --N質(zhì)量濃度均較低(≤1.5 mg/L)，這說(shuō)明菌株Yl0可實(shí)現(xiàn)同步硝化反硝化。
3結(jié)論
(1)通過(guò)分離純化從石油化工廠的活性污泥中篩選出1株異養(yǎng)硝化苯酚降解菌Y10，鑒定為假單胞桿菌。
(2)菌株Y10適宜的培養(yǎng)條件為：溫度為35℃，培養(yǎng)基初始pH =9.0，搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min。在此條件下，質(zhì)量濃度為837 mg/L及1 254 mg/L的苯酚分別在7h和20 h時(shí)均被完全降解，降解率分別為119.6 mg/( L.h)和62.7 mg/( L.h)。
(3)在碳源充足的條件下，Y10可使p(NH3 -N)=114 mg/L在12 h時(shí)全部降解，且產(chǎn)生的
p (NO2- -N)≤1.5 mg/L，表明該菌可實(shí)現(xiàn)同步硝化反硝化。
4摘要：從武漢市某石油化工廠的活性污泥中篩選出1株能降解苯酚的異養(yǎng)硝化菌Y10，通過(guò)生理生化試驗(yàn)及16SrDNA測(cè)序鑒定其為Pseudonzonas sp．屬細(xì)菌。該菌生長(zhǎng)和降解苯酚的適宜條件為：溫度為35℃，培養(yǎng)基初始pH為9．0，搖床轉(zhuǎn)速為
200 r/min。在該條件下，質(zhì)量濃度為837 mg/L及1254 mg/L的苯酚分別在7h和20 h時(shí)被完全降解，降解速率分別為119.6 mg/( L .h)和62,7 mg/(L .h)。以苯酚為唯一碳源且碳源充足時(shí)，Y10能將初始質(zhì)量濃度為114 mg/L的氨氮在12 h時(shí)全部降解，該過(guò)程產(chǎn)生的亞硝酸鹽氮≤1.5 mg/L，表明該菌可實(shí)現(xiàn)同步硝化反硝化。
