基質(zhì)固相分散-氣相色譜熱能檢測法測定電子煙煙油中的TSNAs
張鳳梅，楊光宇，劉志華，朱瑞芝，司曉喜，劉春波，申欽鵬，何 沛，王昆淼，王 晉，繆明明*
（云南省煙草化學重點實驗室，云南中煙工業(yè)有限責任公司技術中心，云南昆明650231）
摘要：利用基質(zhì)固相分散-氣相色譜熱能檢測法測定電子煙煙油中的煙草特有亞硝胺( TSNAs)。電子煙煙油用堿性氧化鋁分散處理，然后用帶柱層析凈化功能的索氏提取器凈化。經(jīng)凈化后的樣品用氣相色譜熱能進行檢測分析。在選定條件下，NNK、NNN、NAB、NAT的4種煙草特有亞硝胺檢出限分別為7.6、12.8、13.2、4.0 n g/m L，方法的回收率為89.6%~94.7%；對樣品進行7次測定，日內(nèi)相對標準偏差為3.2%~4.0%；日間相對標準偏差為4.2% N4-6%，結果令人滿意。
關鍵詞：煙草特有亞硝胺；基質(zhì)固相分散；氣相色譜-熱能分析法；電子煙煙油
中圖分類號：0653. 3 文章編號：0253 - 4320( 2016) 06 - 0191 - 04
DOI:10. 16606/j. cnki. issn 0253 - 4320. 2016. 06. 047
煙草特有亞硝胺( TSNAs)包括N-亞硝基降煙堿( NNN)、4-(甲基亞硝基)-1-（3-吡啶基）-1-丁酮( NNK)、N-亞硝基新煙草堿(NAT)、N-亞硝基假木賊堿( NAB)等，是煙草中一類重要有害成分。目前TSNAs的測定特別是NNK的測定已列為煙草安全評價的重要檢測指標。電子煙作為一種新型煙草制品，是通過煙油直接霧化電子煙油來產(chǎn)生煙氣；由于避免了復雜的煙絲燃燒，其有害成分釋放量比常規(guī)卷煙大大減少。但是電子煙煙油普遍含煙草提取物，TSNAs有可能會因煙草提取物的使用而引入到電子煙煙油中。因此電子煙油中TSNAS的測定對保障電子煙的安全性具有一定意義。
目前測定TSNAs的方法主要有氣相色譜-熱能分析聯(lián)用法(GC -TEA)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC/MS)和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法( LC -MS/MS)等。LC -MS/MS法具有較高的靈敏
度，但由于基質(zhì)效應的影響，方法重現(xiàn)性較差。GC -TEA法對亞硝胺類化合物具有很好的選擇性，測定結果準確，重現(xiàn)性好，但樣品前處理非常復雜，耗時較長，需多次的轉移、濃縮，易造成TSNAs的損失和轉化，影響測定的準確性；而且有機溶劑（二氯甲烷）消耗量很大，樣品前處理過程中大量溶劑向空氣中散發(fā)，環(huán)境污染大。針對現(xiàn)有技術的不足，研究了用基質(zhì)固相分散處理，GC -TEA測定電子煙煙油中TSNAs的方法。電子煙煙油樣品濃縮后用硅膠分散，然后用帶柱層析凈化功能的索氏提取器凈化。經(jīng)提取凈化后的樣品用于測定。該方法簡化了樣品前處理操作步驟，提高了分析結果的精密度；顯著簡化了常規(guī)GC -TEA分析樣品前處理操作步驟，使前處理過程中有機溶劑用量大大減少，從而減少了樣品處理過程中對環(huán)境的污染。
1 實驗部分
1.1 儀器和試劑
氣相色譜-熱能分析聯(lián)用儀，美國ThermoElectron公司生產(chǎn)，色譜柱為彈性毛細管柱(30 m×0. 53 mm x1μm)，固定相為50%甲基-50%苯基聚硅氧烷；保護柱為彈性石英毛細管柱(1 m×0. 53 mm)，經(jīng)脫活處理；分析天平，感量為0.000 1 g，瑞士Mettler Toledo公司生產(chǎn)。
電子煙煙油購于淘寶網(wǎng)；氯仿、丙酮，色譜純，購于美國sigma公司；無水硫酸鈉、堿性氧化鋁（200目~300目），分析純，均購于上海國藥集團化學試劑有限責任公司；亞硝胺標準品和內(nèi)標N-戊基-（3-甲基吡啶基）亞硝胺、NNN、NAT、NAB、NNK，純品（純度大于97%），購于百靈威化學試劑公司。
1.2標準工作溶液
配制TSNAs標準系列工作溶液，以氯仿為溶劑，內(nèi)標N-戊基-（3-甲基吡啶基）亞硝胺的質(zhì)量濃度均為200 n g/m L；NNN、NAT、NNK的質(zhì)量濃度為10、20、50、100、200、500、1 000、1500 n g/m L; NAB質(zhì)量濃度為5、10、20、50、100、200、500、1 000 n g/m L。
1.3帶柱層析功能的索氏提取裝置
帶柱層析功能的索氏提取裝置由回流冷凝管、提取器和圓底燒瓶3部分組成，如圖1所示。
1.4儀器條件
采用規(guī)定的色譜條件，具體參數(shù)如下：程序升溫：初始溫度為150℃，保持2 min;以
3℃/min速率升至230℃，20℃ /min速率升至260℃，保持20 min；進樣口溫度為230℃；載氣為氦氣，恒流10 m L/min進樣量為211L;不分流，不分流時間為1 min；吹掃流量為50 m L/min；熱裂解溫度為550℃；接口溫度為250℃。
TEA參數(shù)采用model 543：裂解溫度為500℃，接口溫度為250℃。
在該儀器條件下標樣和電子煙煙油樣品色譜圖如圖2所示。
1.5樣品前處理及檢測
準確稱取電子煙煙油樣品10 g，然后加入15.0 g的堿性氧化鋁和電子煙煙油充分研磨均勻，并在烘箱中烘干。
在索氏提取裝置中加入20 g氧化鋁層，然后將附著了電子煙煙油的堿性氧化鋁加到索氏提取器中，再在上面鋪5.0 g無水硫酸鈉。裝好樣品后，在燒瓶中加入100 m L V（丙酮）：V（氯仿）=2:8的混合溶劑，然后將上述樣品前處理裝置放入水浴鍋中于75℃加熱回流45 min提取樣品。樣品提取完后，打開三通閥，讓溶劑從溶劑回收口流出，濃縮樣品并回收溶劑，當濃縮到約1.0 m L時停止加熱，取出樣品，用0.45μm的針頭過濾器過濾，即可供分析用。2結果與討論
2.1方法原理
用GC -TEA法測定TSNAs，樣品前處理包含了樣品溶劑提取、氧化鋁柱層析凈化、凈化后的樣品濃縮等。即樣品用二氯甲烷提取，提取液進行濃縮，濃縮后的樣品以二氯甲烷-甲醇為洗脫劑，用氧化鋁柱層析凈化。氧化鋁柱洗脫液再濃縮后供儀器分析用。而采用本文中的裝置，啟動水浴加熱，蒸發(fā)后的溶劑可經(jīng)回流冷凝管冷凝后再次回流到提取器中，經(jīng)無水硫酸鈉層干燥后，再把樣品（負載了電子煙煙油的堿性氧化鋁）上負載的TSNAs洗脫下來；經(jīng)過裝填的堿性氧化鋁凈化，電子煙煙油中的雜質(zhì)則被吸附在堿性氧化鋁柱上，而TSNAs被溶劑洗脫下而進入圓底燒瓶中。經(jīng)過多次循環(huán)回流后，樣品中的TSNAs被完全提取，經(jīng)轉換三通閥讓溶劑從溶劑回收出口流出，這樣圓底燒瓶中的溶液不斷被濃縮，當濃縮到約1.0 m L時停止加熱，取出樣品，即可供分析用。
2.2萃取、凈化溶劑的選擇
TSNAs測定樣品前處理的關鍵步驟是氧化鋁柱層析凈化，溶劑的選擇非常重要，溶劑對氧化鋁柱的洗脫強度適當才能讓TSNAs從氧化鋁柱上洗脫下來，并讓雜質(zhì)更多的保留在柱上，從而達到樣品凈化的目的。傳統(tǒng)方法一般用1種洗脫強度小的溶劑（二氯甲烷）和1種洗脫強度大的溶劑（甲醇）混合作為洗脫劑，通過兩者的比例調(diào)節(jié)洗脫強度。在本方法中，要求2種溶劑的沸點相近，以保持在水浴加熱時能達到基本同時氣化。氯仿的沸點( 61.3℃)
和丙酮的沸點( 56.5℃)非常接近，經(jīng)常使用這2種溶劑混合調(diào)節(jié)溶劑強度作為正相色譜的流動相，因此選擇氯仿和丙酮混合作為本實驗中的提取、凈化溶劑�？疾炝瞬煌w積比的氯仿和丙酮混合對樣品中TSNAs的萃取效率的影響，結果表明：丙酮的體積比過低會導致柱上的亞硝胺洗脫不完全，使測定結果偏低；丙酮的比例過高又會導致大量雜質(zhì)洗脫而達不到預期的凈化效果；丙酮和氯仿的體積比在20: 80時能將樣品中的TSNAs完全萃取，且能達到較好凈化效果，因此，選擇體積比為2：8的丙酮-氯仿作為前處理中的溶劑。
2.3 萃取劑體積的選擇
在本實驗中，需在提取裝置中加入足夠量的溶劑，以保持溶劑在前處理過程中能循環(huán)。實驗結果表明，當提取裝置中的溶劑量達80 m L時能保持正常循環(huán)，但考慮到在樣品前處理過程中溶劑因蒸發(fā)而有少量損失，因此選擇在提取器中加入100 m L的氯仿-丙酮混合溶劑。
2.4水浴溫度的選擇
在本實驗中，氯仿的沸點為61.3℃，丙酮的沸點為56.5℃，當水浴溫度超過70℃時，尾管燒瓶中的溶劑開始沸騰，隨溫度增加，溶劑蒸發(fā)速度迅速加快，當溫度達到75℃時溶劑蒸發(fā)速度能達到10 m L/min左右（稍大于氧化鋁柱上的流下速度），溫度過高則會增加提取過程中的溶劑損失，因此，選擇水浴溫度為75℃。
2.5萃取時間的選擇
選取經(jīng)硅膠分散、烘干后的電子煙油樣品，在75℃的水浴中進行回流提取，考察提取時間對TSNAs測定結果的影響。比較了提取時間分別為20、25、30、35、40、45、50，60 min的測定結果。結果表明：萃取時間在40 min以后萃取效率達到1個穩(wěn)定值，TSNAs的測定結果趨于穩(wěn)定，進一步延長提取時間則會導致更多的雜質(zhì)洗脫下而影響樣品的凈化效果。為節(jié)約時間并避免引入更多的干擾成分，選擇回流45 min作為樣品提取的最佳時間。
2.6工作曲線和檢測限
配制一系列不同TSNAs質(zhì)量濃度標準溶液(內(nèi)標質(zhì)量濃度均為200 n g/m L)進行GC -TEA分析，以標樣峰面積(A)和濃度(C)進行線性回歸，得到線性回歸方程，結果如表1所示。將最低質(zhì)量濃度的標準溶液連續(xù)進樣10次，測定其標準偏差，以3倍標準偏差作為檢出限，以10倍標準偏差作為定量限，具體結果如表1所示。
2.7檢測方法的回收率和精密度
日內(nèi)精密度：電子煙煙油樣品在相同條件下同1天內(nèi)測定7次，并計算7次平行測定結果的相對標準偏差( RSD)，可得4種TSNAs的RSD在3. 2%~4.0%范圍內(nèi)，說明方法精密度良好。
日間精密度：煙草樣品每天測定1次，共7天，計算7次測定結果的相對標準偏差，可得4種TSNAs的RSD在4.2%~4.6%范圍內(nèi)，說明在不同時間內(nèi)測定，方法精密度仍然良好。
測定時每個樣品稱取相同4份，其中1份不加標準品，另3份分別加入已知量的TSNAs（NNK的添加量分別為40、80、160 n g; NNN的添加量分別為50、100、200 n g ;N AB的添加量分別為20、40、80 n g;NAT的添加量分別為100、200、400 n g），樣品按選定的樣品前處理條件處理，并按選定實驗條件進樣分析，通過加標樣品測出量減去未加標樣品測出量（本底），再除以標準加入量計算回收率。得TSNAs的回收率在89. 6%~94. 7%之間，說明方法回收率很高。
2.8部分樣品檢測結果
選擇部分有代表性的樣品，按選定樣品前處理方法處理后進行測定，并用標準方法與堿性氧化鋁柱層析凈化的GC -TEA測定方法作為對照，結果如表2所示。結果表明，該方法的測定結果和煙草行業(yè)標準基本相符合，說明該方法的樣品前處理測定結果和標準方法沒有顯著性差異，測定結果可靠。
3結論
用基質(zhì)固相分散-氣相色譜熱能檢測法測定電子煙煙油中的TSNAs。采用硅膠基質(zhì)固相分散處理，然后用帶柱層析凈化功能的索氏提取器凈化。高效的樣品凈化可分離除去大量的雜質(zhì)，使10 g電子煙煙油中的TSNAs濃縮到1.0 m L的待分析溶劑中，濃縮倍數(shù)達10倍，該方法可滿足電子煙煙油中低質(zhì)量分數(shù)TSNAs的測定。采用新凈化置可將常規(guī)方法中的提取、拄層析凈化、濃縮三步在線連接起來，避免了樣品前處理過程中的轉移、濃縮，簡化了
操作步驟，還可有效減少分析誤差，使測定結果更加準確。而且樣品處理在相對封閉的裝置中完成，避免了常規(guī)前處理方法中許多敞開操作，減少了有機溶劑向環(huán)境中的散發(fā)，降低了環(huán)境污染。總之，該方法準確可靠，重現(xiàn)性好，回收率滿意，檢出限較低，可滿足電子煙煙油中TSNAs快速準確測定的要求。
