酶改性乳清蛋白制備可溶性聚合物及黏度測定
齊微微，劉慕君，梅斯杰，蔡興航，王艷菲，于國萍*
東北農(nóng)業(yè)大學食品學院（哈爾濱150030）
摘要利用谷氨酰胺轉氨酶改性乳清蛋白制備可溶性聚合物，以單因素試驗和正交試驗探討了加酶量、反應溫度、pH、反應時間和4℃冷藏時間對乳清蛋白可溶性聚合物的黏度影響，優(yōu)化了可溶性聚合物的制備工藝。結果表明，四因素對聚合物黏度影響的主次關系為：反應溫度>pH>反應時間>加酶量，反應溫度和pH/-j-黏度的影響顯著。當聚合物的初始黏度（冷藏0 h）為30- 35 m Pa．s時，隨著4℃冷藏時間的延長(0，2，4和6 h)，可溶性聚合物黏度逐漸增大，黏度增速適宜，冷藏6h之后形成凝膠�？扇苄跃酆衔镏苽錀l件為反應溫度50℃、反應時間60 min, pH和加酶量5U/g，所得的聚合物黏度適宜易于應用，穩(wěn)定且具有高凝膠性。
關鍵詞 乳清蛋白；谷氨酰胺轉氨酶；可溶性聚合物；黏度
乳清蛋白可溶性聚合物為介于蛋白單體與不可溶性凝膠網(wǎng)絡結構或沉淀的一種中間狀態(tài)，也稱為溶膠或可流動的凝膠。乳清蛋白改性制備的可溶性聚合物( Soluble aggregates，SA)，改善并拓展了乳清蛋白在起泡、乳化、凝膠、成膜和包埋等方面的應用。正因為SA具有多樣的結構和理化的性質，其在食品中的應用相當廣泛。
關于谷氨酰胺轉氨酶( TGase)改性乳清分離蛋白( WPI)制備聚合物國外的研究較多。S．N．Anuradha研究了TGase( 37 0C，2h)交聯(lián)WPI對其濁度的影響。Cony Gauche優(yōu)化了TGase交聯(lián)乳清蛋白聚合的條件，并研究酶交聯(lián)對于溶液流變性的影響。但是關于TGase改性乳清蛋白制得聚合物黏度的研究報道很少。國內乳清蛋白熱聚合的研究鮮有報道，以乳清濃縮蛋白為原料，研究乳清濃縮蛋白在非常規(guī)條件下( pH 1.8)制備乳清濃縮蛋白納米纖維。利用
TGase聚合大豆蛋白和乳清蛋白形成高耐熱、耐酸的蛋白聚合物；經(jīng)加熱預處理(85 0C，15 min)的WPI,可以利用TGase催化其聚合，同時添加還原劑( DTT)，可明顯提高MTGase對WPI的催化活性。關于TGase催化WPI形成凝膠有研究，但是，TGase催化WPI聚合形成高黏度可溶性聚合物的影響未見研究，試驗旨在研究低劑量的TGase催化聚合乳清蛋白可溶性聚合物的制備及其黏度測定，這將有利于進一步了解TGase催化蛋白聚合的機制。為開發(fā)蛋白基質的食品穩(wěn)定劑提供理論基礎。
1 材料與方法
1.1材料與試劑
乳清分離蛋白( WPI)，蛋白質含量90.90%：新西蘭Fonterra公司；谷氨酰胺轉氨酶(TGase)，酶的活力為100 U/g：泰興市一鳴生物制品有限公司；其余所有試劑均為分析純。
1.2主要儀器與設備
PHS-3C型精密pH計：上海雷磁儀器廠；NDJ-5S旋轉黏度計：上海精密科學儀器有限公司；數(shù)顯恒溫磁力攪拌水浴鍋：常州賽普儀器廠；H-1微型漩渦混合器：上海精科實業(yè)有限公司。
1.3試驗方法
1.3.1乳清分離蛋白溶液的制備
準確稱取11.16 g WPI，用100 m L去離子水溶解，制得11.16%的乳清蛋白溶液，采用凱氏定氮方法測定該溶液的蛋白含量為10%。將溶液輕輕攪拌60min，在4℃條件下冷藏12 h，消除泡沫并使蛋白充分水合。
1.3.2不同反應條件對TGase改性WPI制得可溶性聚合物黏度的影響
1.3.2.1 TGase改性WPI單因素試驗設計
分別考察反應時間(30，60，90，120和150min)、反應溫度(30 ℃，40℃，50 ℃，60℃和70℃)、pH (7.25, 7.50, 7.75, 8.00, 8.25和8.75)和加酶量（1，3，5，7和9 U/g）對TGase交聯(lián)WPI聚合物在不同的冷藏時間下的黏度影響。
1.3.2.2谷氨酰胺轉氨酶改性乳清蛋白正交試驗設計
在單因素試驗的基礎上，每個因素選取3個適宜水平，設計L9(34)正交試驗，優(yōu)化TGase改性WPI制備乳清蛋白可溶性聚合物的最佳條件，結果見表1。
1.3.3乳清蛋白可溶性聚合物黏度的測定
制備的可溶性聚合物冷卻至室溫，測定其黏度，即為0 h黏度，之后將樣品置于4℃冰箱冷藏，分別測定聚合物冷藏2，4和6h的黏度。1 min之內，每隔20s計數(shù)，3個數(shù)值取平均值。
1.4統(tǒng)計分析
試驗數(shù)據(jù)均使用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計分析，所用數(shù)據(jù)均為三次的平均數(shù)，單因素方差分析( ANOVA)中采用Duncan檢驗，圖表中同一條曲線標有相同字母者為差異不顯著(p>0.05)，有不同字母者為差異顯著(p≤0.05)。作圖采用Sigma Plot 9.0軟件。
2結果與分析
2.1酶添加量和冷藏時間對聚合物黏度的影響
加酶量不同制得的聚合物冷藏不同時間黏度的變化如圖1所示。聚合物冷卻至室溫（記為0h），聚合物盼黏度隨著加酶量的增加而增大。同一加酶量，隨著冷藏時間的延長，黏度增大。但是加酶量不同，隨著冷藏時間的延長，黏度的增加速率不同，對照組（加酶量為0 U/g）冷藏6h黏度從10.9增加到103.3 m Pa.s，而加酶量為9 U/g時，聚合物的黏度從32.0增加到6 536.6 m Pa．s。冷藏24 h之后，黏度均超過了10萬m Pa．s，形成凝膠。
a-乳白蛋白的肽鏈中有8個谷氨酸殘基和12個賴氨酸殘基；而p-乳球蛋白有16個谷氨酸殘基和15個賴氨酸殘基，然而由于乳蛋白的球狀結構，不是所有的殘基都能被谷氨酰胺轉氨酶所交聯(lián)。TGase的交聯(lián)度依賴于蛋白的分子結構，即參加反應的谷氨酸殘基數(shù)量和多肽鏈的柔性。一般來說，酶/底物值越大，越有利于酶催化底物。當?shù)孜餄舛纫欢〞r，加酶量會存在一個臨界值。試驗乳清蛋白濃度為10 g/100mL，加酶量最大為9 U/g，遠沒有達到酶濃度的最大值，所以隨著加酶量的增大，黏度一直增大，隨著冷藏時間的延長增速變大。但是黏度增加過大，聚合物會形成不可流動的固體凝膠，試驗制備的是可溶性聚合物，所以加酶量選擇在5～9 u/g。
2.2 pH和冷藏時間對聚合物黏度的影響
圖2表示在不同pH條件下，4qC冷藏0，2，4和6h聚合物的黏度變化。酶的活力受pH的影響，不同酶具有不同的最適pH，在最適pH下，酶的活性最高，催化交聯(lián)效果最好。有研究認為轉谷氨酰胺酶的最適pH范圍為7.00～9.00。從圖2b中可知，聚合物0h的黏在pH 8.00時最大為27.0 m Pa．s，但當pH為8.25、8.50時，黏度變化無顯著性差異，這與胡慧玲研究PHXt TGase交聯(lián)WPI黏度的影響相符。
聚合物冷藏2h后，黏度均增大，pH 8.25時黏度最大，之后黏度降低。隨著冷藏時間的延長，在各個DH條件下，聚合物的黏度逐漸增大，但是增加速率不同，pH 8.25時聚合物增速最大，但是冷藏24 h后，均形成黏度大于10萬mPa．s（除pH 7.25）的凝膠。所以在pH 8.00～8.50時TGase改性WPI制得聚合物0h時黏度較大，且隨著冷藏時間的延長，黏度增速較快，易于形成凝膠。
2.3反應時間、冷藏時間對聚合物黏度的影響
聚合物冷藏0 h時（圖3b）隨著反應時間的延長，谷氨酰胺轉氨酶交聯(lián)作用時間長，聚合物的黏度逐漸增大。當反應時間超過150 min時，聚合物的黏度仍會繼續(xù)增大，但是黏度太大，冷藏2h黏度15 000m Pa．s，冷藏6h黏度超過10萬m Pa．s，不符合研究要求，所以反應時間在60～120 min較適宜。
2.4反應溫度、冷藏時間對聚合物黏度的影響
由圖4b可知，在冷藏0h時，聚合物的黏度隨著溫度的升高而增大，超過60 ℃聚合物的黏度降低，這是由于Gasses催化WPI聚合有一個最適溫度范圍。王金水、于國萍等㈣研究TGase的最適溫度為45℃~55℃ , 60 ℃時酶的活力受抑制．在60 ℃時，未冷藏聚合物(0h)的黏度最大，可能由于溫度升高，乳清蛋白熱變性利于聚合所以黏度提高，而溫度超過60℃ ，
TGase因失活聚合能力下降，聚合物黏度降低。
隨著冷藏時間的延長（圖4a），聚合物的黏度逐漸增大，但是不同的反應溫度，黏度的增速不同，溫度越高，增速越大。當冷藏4h時，加熱溫度70 cC聚合物黏度超過60℃的黏度，可能是熱變性的乳清蛋白冷藏更易聚合，但是黏度增速太大，不利于應用，所以溫度在50℃~60℃比較適宜。
2.5 TGase改性WPI制得可溶性聚合物正交試驗設計
以反應溫度(A)、pH (B)、加酶量(C)和反應時間(D)較優(yōu)水平進行L9(34)正交試驗，確定酶改性乳清分離蛋白制備可溶性聚合物的最優(yōu)工藝條件。
以聚合物冷藏Oh的黏度為指標進行極差分析確定4個因素對聚合物黏度影響的主次關系依次為：A>B>D>C，即溫度影響最大，酶添加量影響最小(表2)。以影響因素C（加酶量）為誤差項對上述試驗結果進行方差分析，結果如表3所示，可以看出因素A（反應溫度）和B( pH)對聚合物的黏度影響均顯著(p<0.05)。也就是說，在實際操作過程中，只有嚴格控制該酶反應的溫度和pH，才能達到預期的目的。
根據(jù)前期試驗得出，當制得聚合物的黏度在30～35 m Pa．s時，聚合物隨著冷藏時間的延長，黏度增速適宜，易于形成凝膠，所以利用Design-Expert軟件的優(yōu)化功能，將黏度的優(yōu)化指標設定為30～35m Pa．s，經(jīng)軟件分析，得出可行方案11個，如表4所示。同時考慮效率及經(jīng)濟性等因素，最終選擇A1B2C3D1最優(yōu)，即溫度為40℃，pH為8.25，酶添加量為5 U/g，反應時間為60 min。按此條件進行驗證試驗，制得的聚合物0h黏度為29.8 m Pa．s，冷藏2，4和6h的黏度分別為2 165, 35 000和85 900 m Pa．s，黏度未超過10萬m Pa．s，黏度增速適宜。
3結論
谷氨酰胺轉氨酶改性乳清蛋白制備可溶性聚合物的最適條件為：反應溫度50℃，pH 8.0，酶添加量5 U/g，反應時間60 min，所得聚合物的初始(0h)黏度為30～35 m Pa．s，黏度適宜，隨著冷藏時間的延長，凝膠形成速率適中，擬可應用于酸奶或酸性乳飲料中作為穩(wěn)定劑和增稠劑。
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