酶法提取番茄籽油脫臭餾出物中維生素E的研究
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劉文玉1，潘軒2，魏長慶2，劉靈針3，單春會(huì)2*
1．新疆石河子職業(yè)技術(shù)學(xué)院（石河子832000）；2．石河子大學(xué)食品學(xué)院（石河子832000）；
3．新疆百禾晶生物科技有限公司（庫爾勒841000）
摘要試驗(yàn)以番茄籽油脫臭餾出物為原料，以脂肪酶為催化劑，通過酶法甲酯化，再將甲酯化產(chǎn)物結(jié)晶，分離甾醇后用正已烷提取維生素E的相關(guān)工藝及參數(shù)進(jìn)了行研究。試驗(yàn)確定脂肪酶最佳反應(yīng)體系為水相體系，結(jié)合響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，確定最佳反應(yīng)條件：料液比1：5 (mg/mL)、酶用量500 U/g、反應(yīng)溫度40℃、反應(yīng)時(shí)間16 h和水分含量為26%時(shí)，番茄籽油脫臭餾出物中維生素E總提取率可以達(dá)到42.78%，與模型理論預(yù)測值43.45%接近。
關(guān)鍵詞 番茄籽油；脫臭餾出物：脂肪酶；甲酯化；生育酚
番茄籽油因其富含番茄紅素、維生素E、β-胡蘿卜素和植物甾醇等眾多營養(yǎng)素而越來越受廣大消費(fèi)者青睞。據(jù)了解，新疆的番茄醬年產(chǎn)量達(dá)200多萬t，在生產(chǎn)過程中產(chǎn)生約20萬t番茄皮籽（干重計(jì)），而如果利用番茄籽生產(chǎn)高檔食用油，可生產(chǎn)4 000 t，創(chuàng)造10億的產(chǎn)值。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，新疆番茄籽油中維生素E含量高達(dá)688～780 mg/kg，眾所周知，天然維生素E具有抗衰老、提高免疫力的作用及對(duì)心腦血管疾病有輔助治療作用，目前已被廣泛用于食品營養(yǎng)增補(bǔ)劑和抗氧化劑及醫(yī)藥、化妝品等方面。然而，在番茄籽油精煉過程中，尤其是高溫脫臭過程中會(huì)造成天然維生素E的大量損失，因此，對(duì)番茄籽油脫臭餾出物中提取天然維生素E是廣大學(xué)者探索方向之一。
目前，維生素E提取方法主要有化學(xué)法、超臨界法、離子交換法和生物法等，其中化學(xué)法具有提取時(shí)間短，工藝簡易，但耗費(fèi)有機(jī)溶劑多，維生素E損失嚴(yán)重或不純；超臨界法雖萃取率高，但是投資大，費(fèi)用高；離子交換法方法簡單，損失率小，但溶劑消耗量大；生物法具有工藝流程簡單，提取率高、成本低廉并且反應(yīng)條件溫和、副產(chǎn)物少和對(duì)天然維生素E營養(yǎng)功能損害小等優(yōu)點(diǎn)，從發(fā)展前景看，利用生物法對(duì)番茄籽油脫溴溜出物的提取天然維生素E是一個(gè)重要方向。因此，試驗(yàn)以番茄籽脫臭餾出物為原料，擬采用生物酶法進(jìn)行天然維生素E提取工藝的研究及優(yōu)化，以期為新疆番茄綜合加工利用附加值的提升提供理論和實(shí)踐依據(jù)。
1 試驗(yàn)材料與方法
1.1試驗(yàn)材料與設(shè)備
1.1.1材料
番茄籽油脫臭餾出物：由新疆百禾晶生物技術(shù)有限公司提供。
1.1.2試劑
無水甲醇（分析純）：天津市致遠(yuǎn)化學(xué)有限公司；甲醇（色譜醇）：天津市富晨化學(xué)有限公司；正己烷（分析純）：天津市致遠(yuǎn)化學(xué)有限公司；脂肪酶( 50 U/mg)：深圳大族鐳射科技股份無限公司；維生素E標(biāo)品：食品藥品檢定院。
1.1.3試驗(yàn)儀器與設(shè)備
BS224-S萬分之一天平：美國Mettler Toledo公司；KQ-200VDE-型雙頻數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；DK-8D型數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市醫(yī)療儀器廠；A-1000S水流抽氣機(jī)：上海愛朗儀器有限公司；LC-2010AHT高效液相色譜儀：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司。
1.2試驗(yàn)方法
1.2.1 天然維生素E提取體系的選擇
稱取3份10 g番茄籽油脫臭餾出物于100 m L帶密封瓶蓋的玻璃反應(yīng)瓶中和甲醇(料醇比為1：4( mg/mL)，分3次等量加入）混合，第一份加入25%水，第二份加入25%的正己烷，第三份不做任何處理，分別置于恒溫水浴鍋中預(yù)熱震蕩，然后向反應(yīng)體系中加入一定量脂肪酶( 400 U/g)，攪拌均勻，蓋好瓶蓋，在恒溫水浴鍋40℃酶解12 h。
1.2.2維生素E的提取方法
根據(jù)2.2.1試驗(yàn)選擇的合適體系，稱取10 g番茄籽脫臭餾出物于100 m L帶密封瓶蓋的玻璃反應(yīng)瓶中，加入25 010純凈水和甲醇(料醇比為1：4(mg/m L)，分3次等量加入），置于恒溫水浴鍋中預(yù)熱震蕩，然后向反應(yīng)體系中加入400 U/g脂肪酶，攪拌均勻，蓋好瓶蓋，在恒溫水浴鍋40℃酶解12 h。反應(yīng)完畢后，將混合液移入分液漏斗中進(jìn)行分離，分出下層甘油層，用蒸餾水洗滌甲酯層。冷卻結(jié)晶去除甾醇(3 0C，3h)，然后真空抽濾后在3 000 r/min的條件下離心10min。取上清液在常溫下與正己烷萃取，物料與萃取劑之比為1：1( mg/m L)，最后將萃取劑蒸發(fā)冷凝回收，得天然維生素E。
1.2.3分析方法
在有水分存在的反應(yīng)體系中，油脂既可以和甲醇發(fā)生醇解反應(yīng)生成甘油和脂肪酸甲酯，油脂部分水解會(huì)生成甘油和脂肪酸，脂肪酸和甲醇發(fā)生酯化反應(yīng)生成脂肪酸甲酯和水，從反應(yīng)產(chǎn)物中萃取維生素E，并利用高效液相色譜分析反應(yīng)產(chǎn)物中維生素E的含量。
1.2.4維生素E含量的測定
高效液相色譜法：色譜條件色譜柱：采用C18柱（長150 mm，內(nèi)徑4.6 mm，粒徑4～5μm）；流動(dòng)相：甲醇（色譜醇）+水（去離子水），比例：(98：2)；流速：0.7 m L/min;檢測波長：290 nm;柱溫：25℃±2 ℃，進(jìn)樣量：20 μL。
1.2.5 VE標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
實(shí)驗(yàn)室的標(biāo)準(zhǔn)品為液體油狀物，因此用注射器抽取直接滴加到容量瓶中稱量，把容量瓶放在分析天平托盤上然后滴加，稱取維生素E標(biāo)準(zhǔn)品約0.100 g，置50 m L棕色量瓶中，加甲醇適量溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成2 mg/m L的溶液作為貯備液。取1 m L貯備液至100 m L的容量瓶中定容。再分別準(zhǔn)確移取2，4，5，6，8和10 m L至10 m L的棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得到質(zhì)量濃度分別為4，8，12，16和20 mg/m L的五種溶液，分別經(jīng)0.45 μm濾膜濾過，濾液作為標(biāo)準(zhǔn)溶液。以標(biāo)準(zhǔn)品溶液質(zhì)量濃度(x)為縱坐標(biāo)，峰面積(y)為橫坐標(biāo)，按照外標(biāo)法過6點(diǎn)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線．見圖1。得標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=1.494 8x×104+2.853×103( R2=0.998 9).
1.2.6樣品的測定
精確稱取3份番茄籽脫臭餾出物10 g，以正己烷為溶劑定容至25 m L容量瓶中，再從中取1 m L定容至10m L為待測樣品。超聲處理10 min，用0.45μm的過濾膜進(jìn)行過濾并上樣，分析條件同2.2.5。
1.2.7單因素試驗(yàn)
番茄籽油脫臭餾出物中維生素E的單因素試驗(yàn)選定水分含量（15%．20%，25%和30%）、料液比(1:3,1:4,l:5,1:6和1:7(mg/m L))、提取溫度（30℃．35℃，40℃，45℃和50℃）、酶用 顯著。量（300，400，500和600 U/g）和酶解時(shí)間(8，12，16，20和24 h)等因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，考察各因素對(duì)維生素E提取率的影響。
1.2.8維生素E提取的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)
應(yīng)用Design-Expert 8.05軟件，根據(jù)Box-Benhnken中心組合設(shè)計(jì)原理，以維生素E提取率為響應(yīng)值，在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，綜合考慮實(shí)際生產(chǎn)的需要，對(duì)提取溫度、水分含量、料液比和酶用量值四個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，因素水平見表1，每個(gè)組合重復(fù)試驗(yàn)3次。
2結(jié)果與分析
2.1維生素E提取體系的選擇
由圖2可知，該脂肪酶在水相體系中更有利于脂肪酶的酶解作用，甲醇和脂肪酶是親水性的極性物質(zhì)，而油脂具有疏水性，并且是非極性物質(zhì)，因此適當(dāng)?shù)暮靠梢蕴岣呙复儆袡C(jī)合成的反應(yīng)速度，增大活化界面，從而使維生素E的提取率增加。
2.2維生素E提取的單因素試驗(yàn)
2.2.1水分含量對(duì)維生素E提取率的影響
從圖3可以看出，當(dāng)水分含量低于25%時(shí)，隨著水分含量的增加，維生素E提取率逐步增大，當(dāng)水分含量大于25%時(shí)，提取率變化成微下降趨勢，這是因?yàn)檫m量的水分可以降低酯交換反應(yīng)產(chǎn)物甘油的濃度，可逆反應(yīng)向右進(jìn)行使反應(yīng)更徹底；適量的水分可以使甲醇分子可以分散開一定的距離避免與酶分子直接接觸，這樣會(huì)降低了甲醇對(duì)酶分子的酶解效果的影響，有利于反應(yīng)的進(jìn)行；當(dāng)水分過量時(shí)，增加了副反應(yīng)水解反應(yīng)的進(jìn)行，同時(shí)酶濃度隨著水分含量的增加而隨之降低，酶解效率降低。因此水分含量對(duì)反應(yīng)的影響顯著。
2.2.2料液比對(duì)酯交換反應(yīng)的影響
由圖4可知，當(dāng)反應(yīng)體系中水分含量一定時(shí)，隨著甲醇用量的增加，維生素E提取率先逐漸增大，當(dāng)料液比達(dá)到1：5( mg/m L)時(shí)，提取率最大，再增加甲醇用量時(shí)，提取率則逐漸減小。這是因?yàn)檫m量的增加甲醇用量不但可以有共溶的體系也有利于酯交換反應(yīng)的進(jìn)行，但甲醇過量的話，甲醇分子在體系中密度會(huì)增大，與酶分子的接觸機(jī)率增加，因此對(duì)酶分子的毒害作用就會(huì)加強(qiáng)。甲醇為親水性溶劑，它將脂肪酸活性中心附近的水分溶解，導(dǎo)致脂肪酶構(gòu)型改變而失活，從而降低酶的活性。
2.2.3酶解溫度對(duì)對(duì)維生素E提取率的影響
由圖5可知，溫度對(duì)維生素E提取率影響較為顯著。隨著反應(yīng)溫度的升高，維生素E的提取率逐步增高，當(dāng)溫度達(dá)到40℃時(shí)，維生素E的提取率達(dá)到最高。當(dāng)溫度超過40 ℃時(shí)，維生素E提取率隨著溫度的升高而降低，這是由于在一定的溫度范圍內(nèi)，溫度的升高，使得反應(yīng)底物碰撞頻率增大，酶促酯解反應(yīng)速度加快，但超過一定范圍，高溫使脂肪酶變性失活；同時(shí)高溫使甲醇分子更活躍對(duì)酶解效果的影響增加，與此同時(shí)，甲醇量的揮發(fā)減少會(huì)使反應(yīng)向副反應(yīng)方向進(jìn)行，因此，選擇最佳酶解溫度為40℃。
2.2.4酶用量對(duì)維生素E提取率的影響
由圖6可知，當(dāng)酶用量低于500 U/g時(shí)，維生素E的提取率隨著酶用量的增加而增大，當(dāng)酶用量達(dá)到500 U/g后，再增加酶量，提取率不再有明顯的變化。這是因?yàn)槊复脔ソ粨Q反應(yīng)時(shí)，在一定的酶濃度范圍內(nèi)，脂肪酶濃度越大，反應(yīng)底物分子與酶分子接觸的頻率越高，酶促酯交換反應(yīng)進(jìn)行得越徹底，但是當(dāng)酶濃度到達(dá)相對(duì)于底物飽和值時(shí)，酶濃度對(duì)酯交換反應(yīng)的影響就不再明顯。因此，最適酶濃度選擇為500 U/g。
2.2.5提取時(shí)間對(duì)維生素E提取率的影響
由圖7可知，酶解提取時(shí)間低于16 h時(shí)，維生素E的提取率隨著時(shí)間的延長而增加，當(dāng)提取時(shí)間大于16h時(shí)，隨著時(shí)間的延長，維生素E的提取率增加幅度微小，這是因?yàn)樵诜磻?yīng)初期，反應(yīng)底物的濃度較大，有利于酶解正反應(yīng)的進(jìn)行；當(dāng)時(shí)間達(dá)到16 h時(shí)，酶與底物的酯交換反應(yīng)以近達(dá)飽和狀態(tài)，反應(yīng)已趨向平衡，再延長時(shí)間對(duì)反應(yīng)影響不明顯，并且易造成維生素E的分解，進(jìn)而使維生素E的提取率降低。因此，選擇最適酶解提取時(shí)間為16 h。
2.3維生素E提取的響應(yīng)面分析
結(jié)合前期預(yù)試驗(yàn)，由于酶用量及酶解時(shí)間對(duì)番茄籽油脫臭餾出物中維生素E提取的影響幅度相對(duì)較小，故在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以提取溫度、料液比和水分含量為三個(gè)可控工藝參數(shù)，以維生素E提取率為指標(biāo)，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)方法來優(yōu)化維生素E提取工藝條件，試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及分析結(jié)果見表2。
利用Design-Expert 8.05軟件，通過表2中試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，獲得維生素E提取率對(duì)編碼自變量水分值、提取溫度和料液比二次多項(xiàng)回歸方程：
由回歸方程可知，因此，在一定范圍內(nèi)可調(diào)節(jié)水分值、提取溫度和料液比使維生素E的提取率達(dá)到所需水平。
由表3方差分析可以看出，試驗(yàn)所選用的二次多項(xiàng)模型具有高度的顯著性（p模型<0.000 3），該模型擬合情況較好，可用該回歸方程代替試驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析�；貧w方程的各項(xiàng)方差分析結(jié)果表明，一次項(xiàng)和二次項(xiàng)都有顯著性因素，因此各試驗(yàn)因素對(duì)維生素E提取率的影響不是簡單的線性關(guān)系。所以，可以利用該回歸方程確定最佳工藝條件。
F直可以反映各因素對(duì)維生素E提取率的重要性，F(xiàn)值越大表明對(duì)天然維生素E提取率的影響越大。由表3可知，F(xiàn)A=12.97，F(xiàn)B=6.33，F(xiàn)C=18.06，即各因素對(duì)提取率影響程度的大小順序：料液比>水分含量>提取溫度。通過Design-Expert軟件分析，模擬得出提取率最高的優(yōu)化組合為A=26.31%、B=40.19℃、C=1：5.28（mg/mL），維生素E提取率最高值為43.45%。
在回歸模型方差分析的基礎(chǔ)上，根據(jù)得到的回歸二次方程，利用Design Expert 8.05軟件作水分含量、提取溫度和料液比對(duì)提取率影響的響應(yīng)面圖，分析兩個(gè)因素交互作用對(duì)維生素E提取率的影響，結(jié)果見圖8。
由圖8可知，在每組交互作用的作用下，維生素E提取率均有最大值，說明各組交互作用均對(duì)維生素E提取率有影響。經(jīng)過確定某一單一因素，在三維圖中查看另一因素的趨勢與之進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)，AB因素之間存在的顯著互交作用，而因素AC、BC交互作用微小，但各圖中兩因素對(duì)維生素E提取率影響的大小只能通過方差分析得出，而不能僅依靠等高線的疏密度判斷。通過軟件分析，水分含量26.31%、溫度40.19℃、料液比1：5.28( mg/m L)，維生素E提取率最高值為43.45%。
考慮到實(shí)際操作的情況，將維生素E提取條件修正為水分含量26%、反應(yīng)溫度40℃、料液比1:5( mg/m L)、酶用量為500 U/g，提取時(shí)間16 h，維生素E提取率最高值為42.78%。該值與理論值接近，說明采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化維生素E的提取工藝可行。
3結(jié)論
通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)確定了酶法提取番茄籽油脫臭餾出物中維生素E的最優(yōu)條件：水分含量26%、反應(yīng)溫度40℃、料液比1：5(mg/m L)、酶用量為500 U/g，番茄籽油天然維生素E提取率的最高值為42.78%。
