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 袁林1，郭建軍1，王賢卓1 ，2，曾靜1，杜建華3

  1．江西省科學(xué)院微生物研究所（南昌330096）；2．南昌大學(xué)中德聯(lián)合研究院（南昌330029）；3．南昌工學(xué)院（南昌330108）

摘要研究了培養(yǎng)基組分（蔗糖、米糠和L-抗壞血酸）及發(fā)酵條件(pH、溫度、接種量和轉(zhuǎn)速)對(duì)茁芽短梗霉P1012 (Aureobasidium pullulans P1012)產(chǎn)普魯蘭多糖的影響，以期提高普魯蘭多糖的產(chǎn)量。研究對(duì)培養(yǎng)基組分進(jìn)行單因素試驗(yàn)及優(yōu)化發(fā)酵條件，再結(jié)合正交試驗(yàn)考察了三因素（米糠、蔗糖和L-抗壞血酸）兩水平對(duì)普魯蘭多糖產(chǎn)量的影響，從而優(yōu)化茁芽短梗霉P1012發(fā)酵工藝，并通過上5L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)驗(yàn)證。試驗(yàn)確定最佳培養(yǎng)基配方為蔗糖70 g/L、米糠3g/L和L-抗壞血酸3 g/L。發(fā)酵條件控制為溫度28℃、pH 5.0、接種量4%以及轉(zhuǎn)速200 r/min。經(jīng)5L發(fā)酵罐培養(yǎng)后，測(cè)定普魯蘭多糖產(chǎn)量達(dá)到43.77 g/L,糖轉(zhuǎn)化率為62.53%。發(fā)酵液pH由5.00升至6.56，黏度達(dá)到52.10mPa．s，具有特別的芳香氣味。獲得茁芽短梗霉P1012的發(fā)酵工藝參數(shù)，為進(jìn)入工業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞  茁芽短梗霉；普魯蘭；正交試驗(yàn)：發(fā)酵工藝

 茁芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）屬于半知菌類短梗霉屬，是一種具有多細(xì)胞形態(tài)的腐生真菌，可合成兩種胞外多糖：普魯蘭多糖和β-葡聚糖（不溶于水的果凍狀物質(zhì)）。其中，普魯蘭多糖又稱為短梗霉多糖，是一類以a(1→6)糖苷鍵鏈接的麥芽三糖重復(fù)單位，具有溶解性、阻氧性和可降解性等特性，現(xiàn)被廣泛運(yùn)用于食品加工、醫(yī)藥和環(huán)境保護(hù)等行

業(yè)中。盡管普魯蘭多糖具有很多特性及巨大的應(yīng)用前景，但市場(chǎng)上商業(yè)化成品還較少。究其原因在于價(jià)格過高，達(dá)到160元/kg，是其他的多糖（如黃原膠）價(jià)格的三倍。因此探究使用價(jià)廉原料作為碳源、氮源等其他培養(yǎng)基組分，可降低普魯蘭多糖的生產(chǎn)成本，促進(jìn)普魯蘭行業(yè)的發(fā)展。Wang等利用谷殼水解物作為碳源用于茁芽短梗霉的發(fā)酵生產(chǎn)，較少原料成本。Sharma等研究了利用米糠油餅、大豆油餅、棉花籽油餅、芥末籽油油餅和玉米漿為氮源發(fā)酵生產(chǎn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)玉米漿最利于提高普魯多糖產(chǎn)量，達(dá)到77.92 g／L。Seo等研究發(fā)現(xiàn)黃豆渣作為碳源，比酵母的效果更好，普魯蘭產(chǎn)量達(dá)到5.5 g/L。Goksungur等運(yùn)用響應(yīng)面發(fā)優(yōu)化馬鈴薯水解物培養(yǎng)基，測(cè)得Aureobasidiumpullulans P56普魯蘭多糖產(chǎn)量為19.2 g/L。試驗(yàn)前期通過復(fù)合誘變過程，選育出一株茁芽短梗霉P1012，但未研究?jī)?yōu)化其培養(yǎng)基組分及發(fā)酵條件。研究采用蔗糖為碳源，米糠作為氮源及其他微量元素的來源，并使用L-抗壞血酸作為特殊添加物，促進(jìn)普魯蘭多糖的合成。試驗(yàn)采用單因素試驗(yàn)、正交試驗(yàn)，最終獲得茁芽短梗霉P1012產(chǎn)普魯蘭多糖的發(fā)酵工藝，并通過發(fā)酵罐驗(yàn)證，從而提高普魯蘭多糖的產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本。

1材料與方法

1.1菌種與培養(yǎng)基

 茁芽短梗霉P1012(Aureobasidium pullulansP1012)由實(shí)驗(yàn)室分離的菌株P(guān)23作為原始菌株，經(jīng)紫外線、亞硝基胍和硫酸二乙酯復(fù)合誘變處理篩選獲得。

 PDA斜面培養(yǎng)基(g/L)：馬鈴薯200，瓊脂粉20，葡萄糖20。

 種子培養(yǎng)基( g/L)：蔗糖20，酵母粉5，自然pH。

 發(fā)酵培養(yǎng)基( g/L)：蔗糖50，米糠3，L-抗壞血酸2。

1.2方法

1.2.1菌種活化及菌液制備

 從斜面（茁芽短梗霉P1012）上挑取一環(huán)種子接種于試管中，28℃，180 r/min搖床培養(yǎng)48 h。按2%的接種量，將活化的菌種液接種于種子培養(yǎng)基中，28℃，180 r/min搖床培養(yǎng)48 h。

1.2.2單因素試驗(yàn)

 研究不同濃度的蔗糖(0，50，60，70，80和90 g/L)，米糠（0，3，4，5和6 g/L）和L-抗壞血酸（0，1，2，3和4 g/L）對(duì)普魯蘭多糖產(chǎn)量的影響，獲得培養(yǎng)基組分的最佳濃度水平，為正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)提供依據(jù)。

1.2.3正交試驗(yàn)

  對(duì)培養(yǎng)基組分（蔗糖、米糠和L-抗壞血酸）進(jìn)行三因素兩水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)助手3.1軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以糖轉(zhuǎn)化率(%)作為衡量指標(biāo)。

1.2.4發(fā)酵條件優(yōu)化試驗(yàn)

 考察溫度(20℃，22℃，24℃，26℃，28℃和30℃)，pH（4.0，4.5，5.0，5.5，6.0和6.5），接種量（2%，4%，6%，8%和10%），轉(zhuǎn)速(100，150，200和250 r/min)對(duì)普魯蘭多糖發(fā)酵生產(chǎn)的影響。

1.2.5發(fā)酵罐驗(yàn)證發(fā)酵工藝

  基于最優(yōu)的發(fā)酵工藝，將活化的種子液接種于SL發(fā)酵罐（上海保興生物設(shè)備工程有限公司），裝液量為3.5 L，通氣量2L/min。發(fā)酵周期為4d，每隔12 h取一次樣，凍存于-80℃超低溫冰箱中。發(fā)酵結(jié)束后，取出所有樣品，測(cè)定生物量，普魯蘭產(chǎn)量等參數(shù)，并繪制發(fā)酵曲線。

1.2.6分析方法

  1)生物量：發(fā)酵液于12 000 r/min下，離心5 min．并收集菌體。將菌體于105℃烘箱過夜，電子天平稱重。

 2)普魯蘭產(chǎn)量：取發(fā)酵液離心后的上清液，加入兩倍體積的無水乙醇，靜止4h。15 000 r/min下，離心8 min，收集多糖沉淀。將多糖沉淀于真空冷凍干燥機(jī)內(nèi)過夜干燥，電子天平稱其質(zhì)量。

 多糖的轉(zhuǎn)化率=普魯蘭產(chǎn)量( g/L)，培養(yǎng)基中蔗糖含量( g/L)×100% (1)

 3) pH:發(fā)酵罐在線測(cè)定（Mettler pH電極）

 4)溶氧( DO)值：發(fā)酵罐在線測(cè)定(Mettler DO電極)。

 5)發(fā)酵曲線繪制：統(tǒng)計(jì)各個(gè)發(fā)酵參數(shù)，并使用軟件Sigma plot 12.0繪制發(fā)酵曲線。

 6)發(fā)酵液的黏度：使用ND-J5S旋轉(zhuǎn)黏度計(jì)（上海昌吉地質(zhì)儀器有限公司）測(cè)定。

2結(jié)果與討論

2.1培養(yǎng)基組分的單因素試驗(yàn)

 由表1—3可知，增加蔗糖濃度，可提高普魯蘭多糖的產(chǎn)量，但糖轉(zhuǎn)化率也隨之降低。米糠作為氮源及微量元素的來源，對(duì)普魯蘭的產(chǎn)量影響較大，最適濃度為4 g/L。L-抗壞血酸作為抗氧化劑，抑制菌體褐化反應(yīng)，提高普魯蘭的產(chǎn)量。研究表明，除了L-抗壞血酸外，大豆油、尿嘧啶和吐溫_80等物質(zhì)，也可以提高普魯蘭的產(chǎn)量。因此普魯蘭多糖產(chǎn)量最高的培養(yǎng)基組成濃度為蔗糖70 g/L、米糠4 g/L以及抗壞血酸2 g/L，可作為正交試驗(yàn)的濃度水平依據(jù)。

2.2影響產(chǎn)普魯蘭多糖的發(fā)酵條件優(yōu)化

 由表4～7可知，溫度、pH、接種量和轉(zhuǎn)速對(duì)普魯蘭的產(chǎn)量都有明顯影響。最適的溫度為28℃，pH5.0。有研究表明高溫，低pH有利于普魯蘭多糖的合成。接種量過低或過低都不利于普魯蘭多糖的合成，原因在于接種量低時(shí)，更多養(yǎng)分用于菌體的生長(zhǎng)，發(fā)酵周期延長(zhǎng)，而接種量過大，則會(huì)影響溶氧。轉(zhuǎn)速的大小影響溶氧，盡管茁芽短梗霉屬于好氧真菌，但過高的溶氧會(huì)對(duì)細(xì)胞質(zhì)膜形成傷害。因此采用接種量4%，轉(zhuǎn)速200 r/min。

 由表8的極差值R和表9方差分析可見，影響普魯蘭多糖產(chǎn)量的培養(yǎng)基組分的順序?yàn)檎崽?#62;L-抗壞血酸(g／L)>米糠，且所有的培養(yǎng)基組分對(duì)普魯蘭多糖產(chǎn)量的影響具有顯著意義(p<0.05)。由試驗(yàn)結(jié)果分析可得茁芽短梗霉P1012培養(yǎng)基的最佳組合為蔗糖70g/L；米糠3g/L; L-抗壞血酸3 g/L。

2.3發(fā)酵罐驗(yàn)證發(fā)酵工藝

 在搖瓶?jī)?yōu)化發(fā)酵條件的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了5L發(fā)酵罐的擴(kuò)大培養(yǎng)。裝液量為3.5 L，加消泡劑0.5%，用Na OH溶液調(diào)pH到5.0，115℃滅菌30 min，培養(yǎng)溫度28 0C，攪拌轉(zhuǎn)速200 r/min，通氣量2 L/min。發(fā)酵4d結(jié)束，此試驗(yàn)重復(fù)3次。試驗(yàn)結(jié)果如圖1。

 從圖1可以看出，pH在0～24 h時(shí)間段內(nèi)，變化較小，但24～72 h內(nèi)，pH不斷升高，最高達(dá)到6.75左右，隨后就開始降低，而使用通用培養(yǎng)基時(shí)，pH變化是不斷下降的過程；溶氧量( DO)從100%降到28.3%，說明茁芽短梗霉是好氧的微生物；發(fā)酵72 h后，開始產(chǎn)生特殊的芳香氣味；發(fā)酵96 h后，黏度達(dá)到52.10mPa．s，普魯蘭多糖產(chǎn)量達(dá)到43.77 g/L，糖轉(zhuǎn)化率為62.53%。由于發(fā)酵罐的攪拌和通氧條件均優(yōu)于搖瓶發(fā)酵，因此，普魯蘭多糖產(chǎn)量和糖轉(zhuǎn)化率都明顯好于搖瓶發(fā)酵。

3結(jié)論

  通過單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)，最終確定茁芽短梗霉P1012最佳發(fā)酵工藝參數(shù)：蔗糖70 g/L，米糠3g/L，L-抗壞血酸3 g/L，溫度28℃，接種量4%，pH 5.0，轉(zhuǎn)速200 r/min。基于最佳發(fā)酵工藝，測(cè)得出茁芽短梗霉P1012的普魯蘭多糖產(chǎn)量達(dá)到43.77 g/L，糖轉(zhuǎn)化率為62.53%，黏度為52.10 mPa．s，具有特殊的芳香氣味。試驗(yàn)采用的培養(yǎng)基（米糠、蔗糖和L-抗壞血酸）組分簡(jiǎn)單，價(jià)格低廉，可為降低普魯蘭多糖的生產(chǎn)成本提供了參考。