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 譚麗娟1，金學(xué)俊1，2，李官浩1，金清1，崔福順1*

 1．延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院（延吉133002）；2．延邊州疾病預(yù)防控制中心（延吉133000）

摘要對(duì)人參莖葉提取液鹽酸水解前后的抗氧化活性進(jìn)行了比較。以DPPH．、羥自由基、超氧陰離子及ABTS+．的清除率、還原能力評(píng)價(jià)抗氧化活性。結(jié)果表明經(jīng)鹽酸水解后的人參莖葉水解液對(duì)DPPH自由基清除率由75.08%提高至85 .12%，羥自由基清除率由43.87%提高至77.90%，超氧陰離子清除率由77.48%提高至90.09%,ABTS+.清除率由83.40%下降至50.89%，還原能力由55.41%下降至24.48%。結(jié)果說明鹽酸水解前后的人參莖葉提取液和水解液均有很好的抗氧化作用。

關(guān)鍵詞人參莖葉；酸水解；抗氧化

 人參是五加科人參屬植物，為名貴中藥，主要分布于我國(guó)吉林、遼寧、黑龍江等省。《神農(nóng)本草經(jīng)》記載的人參藥用部分主要為地下部分，即人參的根和須�，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，人參地上部分如花、果、莖葉中含有與地下部分相同的功效成分，有些成分的含量比地下部分還要高。目前已從人參莖葉中得到皂苷類、黃酮類、多酚類、多糖類等功效成份。人參莖葉中含有的黃酮類主要為人參黃酮苷、山柰酚及槲皮素等。黃酮類化合物廣泛存在于植物中，是植物次生代謝產(chǎn)物，具有抗疲勞、抗腫瘤、提高免疫力、抗氧化等作用。黃酮類化合物多與糖結(jié)合形成黃酮糖苷，只有極少數(shù)以苷元形式存在。近代研究發(fā)現(xiàn)，黃酮苷元清除自由基的活性明顯高于黃酮糖苷，效價(jià)是黃酮糖苷的7倍。

  吉林省是人參生產(chǎn)大省，栽培量占全國(guó)總產(chǎn)量的56%，每年可生產(chǎn)人參莖葉5 000 t。前期研究發(fā)現(xiàn)，人參莖葉乙醇提取液中含有豐富的蘆丁，提取液經(jīng)鹽酸水解后蘆丁幾乎全部轉(zhuǎn)化為黃酮苷元山柰酚，轉(zhuǎn)化率達(dá)96%。因此，通過對(duì)人參莖葉轉(zhuǎn)化前后提取液的抗氧化性比較，為人參資源的綜合開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

1  材料與方法

1.1儀器和試劑

 UV-7504型紫外可見分光光度計(jì)：上海欣茂儀器有限公司；2400 K離心機(jī)：德國(guó)哈默；KQ-500型醫(yī)用數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；LGJ-12冷凍干燥機(jī)：北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；101型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：天津泰斯特儀器有限公司。

  人參莖葉：汪清縣；蘆�。荷虾Ｔ慈~生物科技有限公司；2，2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基(DPPH)、2．2+-聯(lián)氮基雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽( ABTS)、過硫酸鉀：Sigma公司；亞硝酸鈉、硝酸鋁、硫酸亞鐵、過氧化氫、水楊酸、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、鄰苯三酚、Tris-HCl等試劑，均為分析純。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1人參莖葉提取液的制備

1.2.2總黃酮含量的測(cè)定

1.2.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

 將120 0C蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10 mg用70%乙醇溶解并定容到50 m L，配成濃度為0.20 mg/m L標(biāo)準(zhǔn)溶液，準(zhǔn)確吸取0，0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 m L分別置于10 m L試管中，各自用70%乙醇補(bǔ)充至2 m L，加0.3 m L 5%的NaNO2溶液，靜置6 min，然后加入0.3 m L 10%Al(NO3)3溶液，靜置6 min，最后加2 m L 4% Na OH溶液，靜置10 min后于510 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度4。以蘆丁質(zhì)量為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得方程：y=0.003x+0.003 9，R2=0.999 9。

1.2.2.2黃酮含量的測(cè)定及計(jì)算

 準(zhǔn)確吸取提取液0.2 m L，加入70%乙醇補(bǔ)至2mL．按如上標(biāo)準(zhǔn)曲線制備步驟測(cè)定吸光度，按標(biāo)準(zhǔn)曲線算出蘆丁含量，再通過公式(1)進(jìn)行總黃酮含量計(jì)算。

1.3抗氧化活性研究

1.3.1對(duì)DPPH．清除效果

 稱取4 mg DPPH溶于無(wú)水乙醇并定容于100 m L容量瓶中，配成100μmol/L DPPH工作液；將人參莖葉鹽酸水解轉(zhuǎn)化前后的提取液及水解液依次稀釋成5個(gè)不同濃度梯度，分別為原濃度的100%，80%，60%，40%和20%，編號(hào)為5，4，3，2和1（以下試驗(yàn)均相同），各取1 m L，分別加入100μmol/L DPPHI作液2mL，搖勻避光靜置30 min;在517 nm下測(cè)定吸光度為A樣品，以無(wú)水乙醇替代樣品液測(cè)吸光度為A空白；根據(jù)公式(2)計(jì)算其清除率，清除率越大抗氧化能力越強(qiáng)。

1.3.2對(duì)羥自由基清除效果

  將人參莖葉鹽酸水解轉(zhuǎn)化前后的提取液及水解液依次稀釋成5個(gè)不同濃度梯度，編號(hào)分別為5，4，3，2和1；在5個(gè)試管中分別加入9μmol/L的硫酸亞鐵溶液2 m L，8.8 mo/L過氧化氫2 m L，9μmol/L水楊酸2mL，分別加入上述不同濃度的提取液及水解液2 m L，在37℃條件下反應(yīng)30 min，冷卻后于510 nm下測(cè)定吸光度為A樣品，用2 m L的蒸餾水代替樣液測(cè)得吸光度為A空白，根據(jù)公式(2)計(jì)算其清除率，清除率越大抗氧化能力越強(qiáng)。

1.3.3對(duì)超氧陰離子清除效果

 將人參莖葉鹽酸水解轉(zhuǎn)化前后的提取液及水解液依次稀釋成5個(gè)不同濃度梯度，編號(hào)分別為5，4，3，2和1，各取1 m L加入到5個(gè)10 mL容量瓶中，分別加入pH 8.2，0.05 mol/L Tris-HCl緩沖溶液4.5 m L，用蒸餾水補(bǔ)到6.0 mL，在25℃條件下預(yù)熱20 min，再加入0.4mL 6.0 m mol／L鄰苯三酚（含10 m mol/L HC1）溶液，均勻混合，25 0C下反應(yīng)4 min后加2滴8.0 mol/L HCI終止反應(yīng)，然后用蒸餾水稀釋至刻度，在420 nm處測(cè)

1.3.4 ABTS法

  將人參莖葉鹽酸水解轉(zhuǎn)化前后提取液及水解液依次稀釋成5個(gè)不同濃度梯度，編號(hào)分別為5，4，3，2和1；并將7 m mol/L的ABTS+．與2.45 m mol/L的過硫酸鉀溶液等體積混合，避光放置16 h，配成ABTS儲(chǔ)備液；使用前用無(wú)水乙醇將儲(chǔ)備液稀釋至其在734 nm波長(zhǎng)下吸光度為2.00±0.10的ABTS+．工作液。取3 m LABTS+．工作液與0.3 m L不同濃度人參莖葉提取液及水解液，室溫反應(yīng)6 min后迅速與于波長(zhǎng)734 nm處測(cè)得吸光度為A樣品；同樣取3 m L ABTS+．工作液與0.3mL 95%乙醇，室溫反應(yīng)后測(cè)得吸光度為A空白；取3 m L95%乙醇與0.3 m L樣品液測(cè)得吸光度為爿對(duì)照，根據(jù)公式(3)計(jì)算其清除率。

1.3.5還原能力

 采用鐵氰化鉀法：將人參莖葉鹽酸水解轉(zhuǎn)化前后的提取液及水解液依次稀釋成5個(gè)不同濃度梯度，編號(hào)分別為5，4，3，2和1；分別取2 m L的不同濃度的提取液及水解液于試管中，依次加入2 m L 0.2 mol/L pH 6.6的磷酸緩沖溶液和2 m L 1%鐵氰化鉀K，F(xiàn)e(CN)6溶液混勻，在50℃水浴中保持20 min后迅速冷卻，再加入2 m L 10%的三氯乙酸溶液，振蕩混勻后取2 m L的混合液和0.4 m L 0.1%的三氯化鐵溶液，靜置10 min，在波長(zhǎng)700 nm處測(cè)得吸光度為A樣品；用去離子水代替提取液測(cè)得吸光度為A空白；以質(zhì)量濃度為0.25 mg/m L的VC代替提取液測(cè)得吸光度為AVC，根據(jù)公式(4)計(jì)算其相對(duì)還原力。

2結(jié)果與討論

2.1  DPPH．清除能力

 DPPH．在有機(jī)溶劑中是一種穩(wěn)定的自由基，呈紫紅色，在517 nm波長(zhǎng)處有強(qiáng)吸收。當(dāng)有自由基清除劑存在時(shí)DPPH．的孤電子被配對(duì)，使吸收減弱或消失，顏色會(huì)變淺。吸收減弱的程度反映自由基清除劑的活性。由圖1可以發(fā)現(xiàn)，鹽酸水解轉(zhuǎn)化前后人參莖葉提取液及水解液均隨濃度的增加對(duì)DPPH自由基的清除率也增加，并呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系；同時(shí)，轉(zhuǎn)化后的水解液清除率均高于同濃度轉(zhuǎn)化前提取液，轉(zhuǎn)化前后最高濃度的清除率由75.08%提高至85.12%。說明人參莖葉提取液鹽酸轉(zhuǎn)化后的水解液具有更好的清除DPPH自由基作用。

2.2羥自由基清除能力

 羥自由基是體內(nèi)最活潑的活性氧，可誘發(fā)鏈?zhǔn)椒磻?yīng)導(dǎo)致自由基損傷，是氧自由基中危害最大的。水楊酸法是利用過氧化氫與Fe2+混合后產(chǎn)生．OH，而反應(yīng)體系中加入的水楊酸能有效地捕捉．OH，并產(chǎn)生有色產(chǎn)物，該產(chǎn)物在510 nm處有強(qiáng)吸收；若加入的提取液具有清除．OH的作用，就會(huì)與水楊酸競(jìng)爭(zhēng)．OH，使有色產(chǎn)物的生成量減少，從而通過測(cè)定其吸光度來進(jìn)行判定。由圖2可知，鹽酸水解轉(zhuǎn)化前后人參莖葉提取液及水解液均隨濃度的增加對(duì)羥自由基的清除率也增加，轉(zhuǎn)化后的水解液清除率較明顯上升，并呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，但轉(zhuǎn)化前的提取液清除率上升幅度不明顯；同時(shí)，轉(zhuǎn)化后的水解液清除率均高于同濃度轉(zhuǎn)化前提取液，轉(zhuǎn)化前后最高濃度的清除率由43.87%提高至77.90%。說明人參莖中提取液鹽酸轉(zhuǎn)化后的水解液具有更好的清除羥自由基的作用。

2.3超氧陰離子（O2-．）清除能力

 鄰苯三酚在堿性條件下發(fā)生自氧化反應(yīng)生成O2-·和有色中間產(chǎn)物，該物質(zhì)在420 nm處有強(qiáng)吸收，當(dāng)反應(yīng)體系中含有能清除O2-·的物質(zhì)時(shí)它的生成得到抑制，鄰苯三酚自氧化受阻，顏色變淺，420 nm處吸收峰減弱。由圖3可以發(fā)現(xiàn)，鹽酸水解轉(zhuǎn)化前后人參莖葉提取液及水解液均隨濃度的增加對(duì)超氧陰離子的清除率也增加，并呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系；同時(shí)，轉(zhuǎn)化后的水解液清除率將均高于同濃度轉(zhuǎn)化前提取液，轉(zhuǎn)化前后最高濃度的清除率由77.48%提高至90.09%。說明人參莖葉提取液鹽酸轉(zhuǎn)化后的水解液具有更好的清除超氧陰離子作用。

2.4  ABTS+清除能力

 ABTS+自由基是由過硫酸鉀氧化ABTS產(chǎn)生的一種自由基，當(dāng)體系中存在氫供體的抗氧化劑時(shí)，ABTS+自由基會(huì)因發(fā)生還原反應(yīng)而褪色。由圖4可以發(fā)現(xiàn)，鹽酸水解轉(zhuǎn)化前后人參莖葉提取液及水解液均隨濃度的增加對(duì)ABTS的清除率也增加，并呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系；但轉(zhuǎn)化后的水解液清除率低于同濃度轉(zhuǎn)化前提取液，轉(zhuǎn)化前后最高濃度的清除率由83.40%下降至50.89%。說明人參莖葉提取液比經(jīng)鹽酸轉(zhuǎn)化后的水解液具有更好的對(duì)ABTS的清除作用。

2.5還原能力

 當(dāng)反應(yīng)體系中有抗氧化劑時(shí)，會(huì)使鐵離子一鐵氰化鉀復(fù)合物中的三價(jià)鐵轉(zhuǎn)變成二價(jià)鐵，二價(jià)鐵復(fù)合物在700 nm處有最大吸收，吸光度越大表明還原力越強(qiáng)。由圖5可以發(fā)現(xiàn)，鹽酸水解轉(zhuǎn)化后的人參莖葉提取液隨濃度的增加還原能力變化不大，而水解轉(zhuǎn)化前提取液的還原能力隨濃度的增加而增加，并呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系；同時(shí)，鹽酸水解轉(zhuǎn)化前的提取液還原能力高于同濃度轉(zhuǎn)化后的水解液；轉(zhuǎn)化前后最高濃度的還原能力由55.41%下降至24.48%。說明人參莖葉提取液比經(jīng)鹽酸水解轉(zhuǎn)化后的水解液具有更好的還原能力。

3結(jié)論與討論

 1)經(jīng)測(cè)定，鹽酸水解前后提取液中總黃酮含量分別為0.51%及0.55%。前期研究發(fā)現(xiàn)，人參莖葉提取液中含有豐富的蘆丁，經(jīng)鹽酸水解轉(zhuǎn)化后的水解液中含有豐富的山柰酚，說明鹽酸水解將蘆丁幾乎全部轉(zhuǎn)化為黃酮苷元山柰酚。

  2)經(jīng)鹽酸水解后的人參莖葉水解液對(duì)DPPH自由基清除率由75.08%提高至85.12%，羥自由基清除率由43.87%提高至77.90%，超氧陰離子清除率由77.48%提高至90.09%；而ABTS清除率由83.40%下降至50.89%，還原能力55.41%下降至24.48%。由于試驗(yàn)中人參莖葉提取液對(duì)羥自由基清除率，鹽酸水解轉(zhuǎn)后的水解液相對(duì)還原能力等沒有達(dá)到50%，因此，抗氧化性的比較沒有以最高濃度的清除率來表達(dá)。

  3)江慎華等發(fā)現(xiàn)，荷葉提取液采用鹽酸水解后所得酸解產(chǎn)物的抗氧化作用均顯著提高，總還原力也提高。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)鹽酸水解后的人參莖葉水解液比提取液對(duì)DPPH，羥自由基及超氧陰離子具有很好的清除作用，這與江慎華等的結(jié)果一致；但對(duì)ABTS的清除率及還原力，鹽酸水解前的人參莖葉提取液具有更好的清除作用，與他們的結(jié)論不一致。初步推斷人參莖葉黃酮苷元的抗氧化活性的強(qiáng)弱和黃酮的種類等其它因素也有一定的關(guān)系。

 4)人參莖葉資源豐富，其中總黃酮含量較高，提取工藝簡(jiǎn)單。因此，可進(jìn)一步對(duì)人參莖葉總黃酮進(jìn)行研究，有望其成為保健食品，化妝品等抗氧化劑的新原料。