杏仁凝集素提取條件的優(yōu)化及性質
蘇艷玲，韓紅艷，楊艷君
晉中學院生物科學與技術學院（晉中030600）
摘要 以苦杏仁為研究材料，展開杏仁凝集素提取條件優(yōu)化的試驗，并對部分性質進行研究。結果表明，杏仁凝集素粗提液對人B型血的血凝效果較好：浸提液PBS+CaCl2的凝集活性最高；采用均勻設計的方法優(yōu)化杏仁凝集素的提取工藝，得到回歸方程為：Y=0.162 1+0.139 0X1-0.016 44X12+0.015 96X2X3，最佳組合為：X1（時間）20.65 h，X2（料液比）1：13 (g/m L), X3（飽和硫酸銨質量分數(shù)）80%，理論凝集活性為0．854 6．經驗證試驗得到杏仁凝集素粗蛋白的凝集活性為0.685 4。杏仁凝集素具有雙糖和糖衍生物的專一性，而沒有單糖的專一性；pH在4.5～9.5，溫度30℃～50℃時具有較高的活性。
關鍵詞 杏仁；凝集素；血凝活性
凝集素是一種具有能與不同種類糖殘基可逆結合位點的非免疫源性的蛋白質或糖蛋白，廣泛分布于植物的種子、根、莖、葉、皮和果實等各種組織器官中。凝集素最典型的特征是能與紅細胞表面特異糖基發(fā)生專一性結合，直觀的表現(xiàn)為使紅細胞發(fā)生凝集，除此之外，在抑制腫瘤細胞增殖、轉基因抗蟲和防御病原體侵入等醫(yī)藥和農業(yè)領域也取得了一定的功效。目前研究得最為清楚的凝集素家族是豆科凝集素，唐超研究了黑豆凝集素的提取條件，以雞血檢測凝集效價，得出用PBS浸提的提取率最高 為9.17%；趙則海提取了四棱豆葉中的凝集素，指出血凝效果評價準確性上凝集活性( Aa)高于凝集效價，且提取液中蛋白質含量與凝集活性之間有顯著相關性；劉超研究了不同理化因素對白蕓豆凝集素的影響，得出白蕓豆凝集素具有較強的耐熱和耐酸堿能力，依賴Mn2維持凝血活性，對鹽酸胍、脲和SDS具有較強的穩(wěn)定性。凝集素作為當今研究的熱點之一在其他植物的種子、葉片和果實上也進行了大量的研究，如花生、核桃和苦蕎等，但是有關杏仁中凝集素的提取及凝血作用等研究報道鮮見。
杏仁是薔薇科杏屬植物的種子，分為甜杏仁和苦杏仁兩種，其營養(yǎng)價值很高，尤其是蛋白質含量(25%)僅次于大豆蛋白。隨著人們健康意識的增強，結合杏仁良好的醫(yī)療效用，很多學者開展了杏仁蛋白的研究，其中杏仁多肽因具有抗氧化、降血壓和增強免疫等特殊生理功能而成為研究的熱點。但有關杏仁中的更多生物活性成分，包括凝集素及其在植物源凝集素中的分類、功能等的研究還有待揭示。試驗首次用均勻設計法優(yōu)化了杏仁凝集素( Almondlectin, AL)粗蛋白的提取工藝，并對其性質進行了初步研究，為今后杏仁凝集素生物學功能及應用的深入研究提供一定的基礎。
1材料與方法
1.1試驗材料
苦杏仁：市售。
不同血型（A、B、AB和O）的人血，用淺藍色頭蓋的枸櫞酸鈉凝血試驗管采集于晉中市四處醫(yī)院化驗科。
1.2試驗儀器與試劑
OHG-907835-Ⅲ型電熱恒溫鼓風干燥箱：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；FA1004電子天平：上海精科天平；EU-2600R型紫外可見分光光度計：上海昂拉儀器有限公司；DZKW-4型電子恒溫水浴鍋：北京中興偉業(yè)儀器有限公司；GL-20G-Ⅱ型離心機：上海安亭科學儀器廠生產；DS-1型組織搗碎機：金壇市水北科普實驗儀器廠。
考馬斯亮藍G-250、磷酸氫二鈉、磷酸二氫納、肝素鈉、氯化鈉、硫酸銨、氯化鎂、氯化鋇：分析純試劑，天津市天大化學試劑廠；標準牛血清白蛋白：北京奧博星生物科技有限責任公司。
1.3試驗方法
1.3.1杏仁凝集素粗提液的制備
選取顆粒飽滿的杏仁10 g，溫水浸泡去皮，于400C烘干后用組織搗碎機粉碎，經索氏提取器抽提16 h脫脂后取出置于培養(yǎng)皿中在通風櫥中晾干。稱取樣品3g，按照物料比1:7（g/m L）加入浸提液，攪拌后置于4℃冰箱中浸提。之后于12 000×g離心30 min，棄去沉淀在上清液中加入硫酸銨進行鹽析，并于4℃條件下浸泡24 h．12 000×g離心40 min，棄上清液，將離心后的沉淀裝透析袋在PBS溶液中透析12 h，然后換成蒸餾水透析除鹽5～6 h，用0.1 mol/L的BaCI2溶液檢測直至無白色沉淀為止，12 000×g離心30 min，去除不溶性物質即為杏仁凝集素粗提液。
1.3.2 2%血細胞懸液的制備
人的A、B、O和AB型血樣用稀的PBS溶液漂洗4～6次，每次1 000 r/min離心5 min，棄上清液，用PBS溶液配成2%的PBS-紅細胞的懸浮液。
1.3.3杏仁凝集素凝血活性的測定
用96孔V板以倍比稀釋法測定凝血活性。用微量移液器在96微孔板各排第一孔和第二孔中加入25μL凝集素，再取25μ L PBS緩沖液加入第二孔，混勻后亦取出25 μL加入第三孔，按此方法倍比稀釋到第12個孔，混勻后吸取25μL棄掉，再在每孔中加入25μL紅細胞懸液，室溫條件下放置30 min，觀察凝集效果，若沒有凝集，則紅細胞在底部形成一個光滑的小圓點；若發(fā)生凝集，則紅細胞呈散落狀分布。以2n表示凝集效價，即杏仁凝集素能使紅細胞發(fā)生凝集反應的最大稀釋倍數(shù)，對其進行量化，其加權平均數(shù)作為量化的凝集活性( Agglutinating activity，A a)，見表1。
1.3.4杏仁凝集素粗提液的血細胞凝集活性分析
采用0.2 mol/L pH 7.4磷酸鹽緩沖液(PBS)按照杏仁凝集素粗提液制備的方法提取杏仁凝集素，研究其對人不同血型的血細胞凝集活性。
1.3.5最佳浸提緩沖液的確定
采用0.2 mol/L pH 7.4 PBS、蒸餾水、0.9%生理鹽水、PBS+0.01 mol/L CaCl2和PBS+0.01 mol/L MgCl2五種不同的浸提液在相同的條件下進行浸提，通過測定提取液對人B型血的凝集活性，確定最佳的浸提溶液。
1.3.6杏仁凝集素最佳提取條件的優(yōu)化
采用均勻設計L9(53)優(yōu)化杏仁凝集素粗蛋白提取工藝。試驗選取浸提時間、料液比和飽和硫酸銨濃度3因素，根據(jù)試驗因子選取均勻設計使用表，見表2。
1.3.7杏仁凝集素的性質
1.3.7.1糖專一性
將葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、a-果糖、a-甘露糖和N-乙酰-D-葡萄糖胺溶解于PBS緩沖液中，配置成0.1 mol/L的糖溶液，取杏仁凝集素粗提液按照倍比稀釋法加在96孔V型板上，之后加入等體積分數(shù)的2%的B型血細胞懸液，于37 ℃水浴中反應30 min，測定凝集效價㈣。
1.3.7.2 pH穩(wěn)定性
用PBS+CaCl2緩沖液將杏仁凝集素pH調到4.5，5.5，6.5，7.5，8.5和9.5，攪拌透析2h，加入等體積分-數(shù)2%的B型血細胞懸浮液進行凝集效價的測定。
1.3.7.3溫度穩(wěn)定性
杏仁凝集素粗提樣品在溫度為30 ℃，40℃，50℃ , 60℃，70℃，80℃，90℃和100℃的恒溫水浴中保溫10 min后冷卻至25℃，加入等體積分數(shù)2%的B型血細胞懸浮液進行凝集效價的測定。
1.4數(shù)據(jù)分析
采用DPS 7.05對數(shù)據(jù)進行分析
2結果與分析
2.1杏仁凝集素粗提液血細胞凝集活性的分析
按照1.3.1的方法提取杏仁凝集素粗提液，研究其對人不同血型的血細胞凝集活性的結果，見表3。
由表3可知，杏仁凝集素粗提液對B型血的凝集效果最好，稀釋至27仍有活性，其次對O型血的凝集效果好，其他兩種血型的凝集效果不好，尤其是A型血，因此，試驗選擇B型血作為杏仁凝集素提取工藝優(yōu)化的供試血型。
2.2最佳浸提緩沖液的選擇
在浸提時間15 h，料液比1：7(g/m L)，70%飽和硫酸銨質量分數(shù)沉淀下，研究不同的浸提液對杏仁凝集素的凝集活性，結果見圖1。
由圖1可知，不同浸提劑提取杏仁凝集素的凝集活性大小為：PBS+CaCl2>PBS+MgCl2>PBS >0.9%生理鹽水>蒸餾水，因此，試驗選取PBS+CaCl2作為杏仁凝集素浸提的緩沖液。
2.3均勻設計提取工藝的結果
杏仁凝集素粗蛋白提取的均勻試驗結果見表4。
通過DPS 7.05軟件進行多元回歸模型的建立，采用二次多項式逐步回歸分析，獲得提取杏仁蛋白的回
回歸方程的相關系數(shù)R=0.998 9，F(xiàn)=149.99(p：0.059 9<0.1)，Durbin-Watson統(tǒng)計量d=1.87，
接近2，對回歸方程進行通徑分析，決定系數(shù)=0.997 78，剩余通徑系數(shù)=0.047 09，說明通徑分析成立。綜合分析結果表明，回歸方程可以反映多元線性回歸模型，回歸分析有效。
由表5可知，X1（時間）對杏仁凝集素粗蛋白提取有顯著影響，X2（料液比）和X3（飽和硫酸銨質量）未列入方程，說明它們兩個因子在試驗設置的范圍內對杏仁凝集素粗蛋白提取并沒有顯著影響，但是X2（料液比）與X3（飽和硫酸銨質量）交互項對杏仁凝集素粗蛋白提取的影響達到顯著水平，且兩者呈正相關。
2.4杏仁凝集素粗蛋白最佳提取條件的驗證試驗
對方回歸程進行模擬尋優(yōu)，得到了杏仁凝集素粗蛋白提取的最佳組合為X1=4.13，X2=5，X3=5，即時間20.65 h，料液比1：13( g/m L)，飽和硫酸銨質量分數(shù)80%，此時的理論凝集活性為0.854 6。根據(jù)優(yōu)化后的條件提取杏仁凝集素粗蛋白，凝集活性為0.685 4，與回歸方程的結果相近，說明該方程可用于杏仁凝集素粗蛋白凝集活性的分析，進一步驗證了該方程的有效性。
2.5杏仁凝集素的性質
2.5.1糖專一性
杏仁凝集素粗提液對7種糖的專一性結果見表6。
由表6可知，試驗中所選的3種單糖對杏仁凝集素的抑制作用不敏感，雙糖和乙酰化的糖鏈有抑制作用，且麥芽糖的抑制作用效果最明顯，高于乳糖和蔗糖，說明杏仁凝集素分子中含有這些糖互補的結合位點。不同的凝集素與糖的特異性結合是不同的，花生種子凝集活性可被乳糖、蜜二糖、棉籽糖和D-半乳糖四種糖所抑制，核桃凝集活性可被糖的衍生物所抑制，但不能被常見的單糖和寡糖抑制，龍須菜凝集活性會被D-木糖、D-果糖、D-甘露糖、L-阿拉伯糖、麥芽糖、蔗糖及乳糖抑制，凝集素是否與單糖或雙糖結合可能與分子量大小和濃度有一定的關系。
2.5.2 pH穩(wěn)定性
杏仁凝集素粗提液對pH穩(wěn)定性結果見表7。
由表7可知，杏仁凝集素在pH 6.5左右的凝集效價較高，在酸和堿性的條件下仍然表現(xiàn)出一定的凝集效價，說明該凝集素對pH的適應范圍較廣，能進行一定的凝集反應。
2.5.3溫度穩(wěn)定性
杏仁凝集素粗提液對溫度穩(wěn)定性結果見表8。
由表8看出，杏仁凝集索有廣泛的熱穩(wěn)定性，在30℃～80℃都表現(xiàn)出一定的凝集效價，且溫度在30℃～50℃時凝集效價較高，之后隨著溫度的升高，凝集效價降低，到90℃無凝集作用。
3結論
1)杏仁凝集素粗提液對人B型血的血凝效果較好；浸提液PBS+CaCl2的凝集活性最高。
2)采用均勻設計的方法優(yōu)化杏仁凝集素的提取工藝，建立了多元回歸模型，得到回歸方程為：
3)杏仁凝集素具有雙糖（麥芽糖、乳糖及蔗糖）和乙�；擎湥∟-乙酰葡萄糖胺、N-乙酰神經酰胺）的專一性，而沒有單糖的專一性；pH的適應范圍較廣(4.5~9.5)，溫度在30℃~50℃時凝集效價較高。
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