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 劉文穎，谷瑞增，魯軍，潘興昌，蔡木易*

 中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京市蛋白功能肽工程技術(shù)研究中心(北京100015)

摘要為了考察小麥低聚肽中抗氧化肽的活性和結(jié)構(gòu)，試驗以谷朊粉為原料，采用兩步酶解法制備出小麥低聚肽，在對其基礎(chǔ)理化成分進行分析的基礎(chǔ)上，測定了其總抗氧化活性。結(jié)果表明，小麥低聚肽中總蛋白質(zhì)含量為98.32%±7.25%，酸溶蛋白質(zhì)含量為93.71%±7.10%，脂肪含量為0.05%±0.01%、灰分含量為4.35%±0.46%、水分含量為4.28%±0.33%。小麥低聚肽的總抗氧化能力為2.3±0.1 m mol/100 g。然后利用反相高效液相色譜(RP-HPLC)對小麥低聚肽進行分離純化，收集6個主要的組分峰，利用Q-TOF質(zhì)譜儀測定肽序列，鑒定出的15個肽段中，有3個肽段PY、LY和APSY的總抗氧化能力比小麥低聚肽強，分別為3.0±0.2，2.7±0.2和2.4±0.1 m mol/100 g。

關(guān)鍵詞  小麥低聚肽；分子量分布；抗氧化肽；分離純化；結(jié)構(gòu)鑒定

 人體產(chǎn)生的自由基及其誘導(dǎo)的氧化反應(yīng)與多種疾病密切相關(guān)，并可加速人體衰老�？寡鮿┠苡行�清除自由基，延緩人體衰老和預(yù)防疾病。人工合成的抗氧化劑如BHT、BHA雖然抗氧化效果很好，但對人體有潛在的毒副作用，加上人們?nèi)找孀非蟓h(huán)保，因此，近年來尋找天然、安全的生物抗氧化劑成為國內(nèi)外的研究重點。天然抗氧化活性肽因具有較強的活性和很高的安全性，而備受科研工作者的關(guān)注，已成為目前的研究熱點。

 小麥低聚肽是以谷朊粉為原料，經(jīng)過酶解、分離、純化等制成的小分子肽混合物，具有多種生理活性，如抗氧化、增強免疫和緩解疲勞等。目前，國內(nèi)外對小麥低聚肽的抗氧化活性缺乏深入和系統(tǒng)的研究，并且發(fā)揮作用的具體活性肽段的結(jié)構(gòu)并不明確。試驗以谷朊粉為原料，通過兩步酶解法制備出小麥低聚肽，在對其基礎(chǔ)理化成分進行分析的基礎(chǔ)上，以反相高效液相色譜( RP-HPLC)、四極桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜儀( Q-TOF MS)為檢測手段，對小麥低聚肽中的抗氧化肽段進行分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定，以期明確小麥低聚肽中抗氧化肽的活性及其結(jié)構(gòu)，旨在為天然、安全的抗氧化保健食品的開發(fā)奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1  材料和方法

1.1材料與儀器

1.1.1材料

 谷朊粉：北京中食海氏生物技術(shù)有限公司；堿性蛋白酶、中性蛋白酶：諾維信生物技術(shù)有限公司；總抗氧化能力檢測試劑盒（FRAP法）：碧云天生物技術(shù)研究所；乙腈：美國Fisher公司，色譜純；三氟乙酸：英國Alfa Aesar公司，分析純。

1.1.2儀器與設(shè)備

 HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋：普瑞斯機械有限公司；YG30噴霧干燥機：無錫市陽光干燥設(shè)備廠；LC-20AD型高效液相色譜儀：日本島津公司；Q-TOF2正交加速電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜儀：英國Micromass公司；SpectraMR酶標儀：美國DYNEX公司。

1.2方法

1.2.1小麥低聚肽的制備

 將谷朊粉溶解于蒸餾水中，濃度為10%→用均質(zhì)機均質(zhì)10 min→調(diào)節(jié)pH為8.5，溫度為55 0C，以每克蛋白質(zhì)2 500單位的酶量加入堿性蛋白酶，酶解2h→調(diào)節(jié)pH為7.0，溫度保持45℃，以每克蛋白質(zhì)2 500單位的酶量加入中性蛋白酶，酶解2 h→升溫至100 0C,滅酶10 min→6 000×g離心15 min，取上清液→用截留分子量為2×106 u的陶瓷膜過濾，取中間清液→用截留分子量為1000 u的超濾膜超濾，得到分子量小于1 000 u的濾過液→噴霧干燥，得到小麥低聚肽干粉

1.2.2小麥低聚肽的基礎(chǔ)理化成分測定

 蛋白質(zhì)含量測定采用GB/T 5009.5規(guī)定的方法，以干基計，蛋白質(zhì)換算系數(shù)為6.25;酸溶蛋白質(zhì)含量測定采用三氯乙酸法；脂肪含量測定采用GB/T 5009.6規(guī)定的方法；灰分含量測定采用GB/T 5009.4規(guī)定的方法；水分含量測定采用GB/T 5009.3規(guī)定的方法。

1.2.3總抗氧化能力測定

  使用總抗氧化能力檢測試劑盒（FRAP法）。該法原理為酸性條件下抗氧化物可以還原Fe3+-三吡啶三吖嗪（Fe3+-TPTZ）產(chǎn)生藍色的Fe2+-TPTZ，隨后在593nm測定藍色的Fe2+-TPTZ即可獲得樣品中的總抗氧化能力。試驗操作步驟參考試劑盒說明書進行。

1.2.4小麥低聚肽的分離純化

采用RP-HPLC對小麥低聚肽進行分離純化。色譜條件為樣品質(zhì)量濃度：10 mg/m L;流動相A：V（水）：V（三氟乙酸）=100：0.1;流動相B：V（乙腈）：V（水）：V（三氟乙酸）=80：20：0.1;檢測波長：UV 220 nm;流速：0.6 m L/min；柱溫：320C；進樣體積：50ILL。梯度洗脫程序：0～50 min．0~15%流動相B; 50～120 min，15%～40%流動相B：120～140 min，40%～80%流動相B；140.01 min, 0%流動相B。分管收集6個組分峰，利用氮吹儀除去乙腈、三氟乙酸等有機溶劑，真空冷凍干燥，得各組分干粉備用。

1.2.5抗氧化肽的結(jié)構(gòu)鑒定

 采用Q-TOF2正交加速電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜儀進行結(jié)構(gòu)鑒定，質(zhì)譜條件為：離子化方式：納升電噴霧正離子；霧化氣體：N2；碰撞氣體：A r;源溫：80℃；錐孔電壓：50V; TOF加速電壓：9.1 kV;  MCP檢測器電壓：2 150 V;毛細管電壓：800 V; MS和MS/MS的質(zhì)量準確度：0.1 n。首先進行一級質(zhì)譜掃描，得到ESI-MS圖。從ESI-MS圖中選出待測離子，然后進行ESI-MS/MS分析。質(zhì)譜圖經(jīng)Micromass的Max Ent 3轉(zhuǎn)換后，由Peptide Sequencing推導(dǎo)出肽段序列。

1.2.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

 每組試驗重復(fù)3次，采用Excel計算不同指標的平均值和標準偏差，所有圖中誤差值采用SD值。

2結(jié)果與討論

2.1小麥低聚肽的基礎(chǔ)理化成分

 結(jié)果顯示，小麥低聚肽中總蛋白質(zhì)干基含量為98.32%±7.25%，酸溶蛋白質(zhì)含量為93.71%±7.10%．占總蛋白質(zhì)95.31%。脂肪含量為0.05%±0.01%、灰分含量為4.35%±0.46%、水分含量為4.28%±0.33%。小麥低聚肽中蛋白質(zhì)含量很高，酸溶蛋白質(zhì)所占比例較大，說明小麥低聚肽的主要成分是較低分子量的肽類物質(zhì)以及少量的游離氨基酸。

2.2小麥低聚肽的總抗氧化能力

 試驗結(jié)果表明，小麥低聚肽的總抗氧化能力為

2.3±0.1 m mol/100 g。

2.3小麥低聚肽的分離純化

 小麥低聚肽是由多種肽段組成的小分子肽的混合物。通過進一步研究，可找到小麥低聚肽中發(fā)揮活性的主要組分。目前，分離純化方法主要有高效液相色譜、離子交換層析、凝膠過濾色譜、聚丙烯酰胺凝膠電泳、超濾等。其中，RP-HPLC法是根據(jù)肽的極性大小而達到分離樣品的目的，能夠達到很好的分離效果，是最常用也是最有效的分離純化方法，具有操作簡便、分辨率高、重復(fù)性好和色譜過程穩(wěn)定等優(yōu)勢。小麥低聚肽的分離色譜圖如圖1所示，依據(jù)峰形、峰高、峰面積和分離度四個指標，收集了6個組分峰，分別命名為1*~6*，每個組分峰里含有的可能不是單一肽段，通過質(zhì)譜分析便可對肽段進行鑒定。

2.4小麥低聚肽中抗氧化肽的結(jié)構(gòu)鑒定

 利用Q-TOF質(zhì)譜儀對收集的6個RP-HPLC組分進行分析。Q-TOF質(zhì)譜儀采用電噴霧離子源(ESI)和飛行時間質(zhì)量分析器( TOF)，通過對各個組分二級質(zhì)譜的碎片離子的質(zhì)譜圖解譜得到肽段的氨基酸序列結(jié)構(gòu)。Q-TOF是蛋白測序的一種新方法，最強大的功能是能夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)進行測序，優(yōu)點是樣品用量少，并且能夠測定肽段的序列。從小麥低聚肽的RP-HPLC組分中鑒定出的肽段結(jié)構(gòu)如表1所示。這些肽段序列的分子量均在1 000 u以下，分別為二肽、三肽和四肽。

 將這些肽段合成標準品，測定其總抗氧化能力。15個肽段中，有3個肽段的總抗氧化能力比小麥低聚肽強，其中PY的總抗氧化能力最強，為3.0±0.2 m mol/100 g，其次是LY和APSY，分別為2.7±0.2 m mol/100 g和2.4±0.1 m mol/100 g。這三個抗氧化肽的C末端都是酪氨酸，推測酪氨酸可能對這些肽段的抗氧化活性起到了一定的作用。其余肽段的總抗氧化能力較弱，但這些肽段與抗氧化肽段的協(xié)同作用可能對整體小麥低聚肽的總抗氧化能力有一定的作用。

3結(jié)論

  試驗以谷朊粉為原料制備小麥低聚肽，其總蛋白質(zhì)含量為98.32%±7.25%，酸溶蛋白質(zhì)含量為93.71%±7.10%，脂肪含量為0.05%±0.01%、灰分含量為4.35%±0.46%、水分含量為4.28%±0.33%。小麥低聚肽的總抗氧化能力為2.3±0.1 m mol/100 g。利用RP-HPLC對其進行分離純化，收集6個主要的組分峰，利用Q-TOF質(zhì)譜儀測定肽序列，鑒定出的15個肽段中，PY、LY和APSY的總抗氧化能力比小麥低聚肽強，分別為3.0±0.2，2.7±0.2和2.4±0.1 m mol/100 g，推測這些抗氧化肽C末端的酪氨酸對抗氧化活性起到了一定的作用。試驗明確了小麥低聚肽的抗氧化活性，并對其含有的抗氧化肽進行了分離和結(jié)構(gòu)鑒定，為小麥低聚肽作為抗氧化保健食品的開發(fā)利用提供了理論支持。