微波輔助稀酸預(yù)處理玉米芯同步糖化發(fā)酵制備乙醇
相關(guān)鏈接： 中國安全網(wǎng) 中國質(zhì)量網(wǎng) 中國論文網(wǎng) 中國資訊網(wǎng)
龐建光1，陳雪橋2，張明霞2，朱錚1
1．河北工程大學(xué)建筑學(xué)院（邯鄲056038）；2．河北工程大學(xué)理學(xué)院（邯鄲056038）
摘要采用微波輔助稀酸預(yù)處理玉米芯以除去半纖維素和果膠等雜質(zhì)，并降低纖維素的結(jié)晶度，然后經(jīng)同步糖化發(fā)酵制備燃料乙醇，建立了制備乙醇的最佳工藝條件。利用熱帶假絲酵母種子液接種，發(fā)酵底物濃度20 g/100 m L，纖維素酶添加量質(zhì)量分數(shù)為2%（相對于干物料），接種量體積分數(shù)為10%, 150 r／mi，330C振蕩培養(yǎng)-48 h，終點乙醇產(chǎn)量達到30.98 g/L。采用分批補料方式，底物濃度提高到30 g/100 m L，其他條件不變培養(yǎng)-60 h，終點乙醇產(chǎn)量達到41.23g/L。
關(guān)鍵詞 玉米芯；熱帶假絲酵母；同步糖化發(fā)酵；燃料乙醇
為應(yīng)對即將到來的能源危機，自上個世紀(jì)以來，世界許多國家的科研及相關(guān)機構(gòu)已開展了利用纖維素類農(nóng)業(yè)廢料生產(chǎn)燃料乙醇的研究工作。美國、日本等國已進行了萬噸以上纖維素類物料生產(chǎn)乙醇的初步工程設(shè)計。我國在利用纖維素類農(nóng)業(yè)廢料生產(chǎn)燃料乙醇方面也很重視，國家《可再生能源中長期發(fā)展規(guī)劃》規(guī)定不再擴大以糧食為原料的燃料乙醇生產(chǎn)規(guī)模，而要積極發(fā)展以纖維素類物質(zhì)為原料的生物液體燃料技術(shù)。
中國是農(nóng)業(yè)大國，纖維素類原料非常豐富，僅農(nóng)作物秸稈類達7億t／年，利用生物法將其轉(zhuǎn)化為燃料乙醇，不僅可以解決人類面臨的能源危機，還可以充分利用自然資源實現(xiàn)廢物利用，緩解糧食危機，同時還能減少CO2排放，改善環(huán)境。我國北方地區(qū)，玉米是主要的糧食作物，每年產(chǎn)生玉米芯的數(shù)量十分可觀。玉米芯中多縮戊糖占35%～40%，是制備低聚木糖、木糖以及木糖醇的最佳原料之一。纖維素占32%～36%，可降解生成葡萄糖等單糖，微生物進一步發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇，或者利用能同時發(fā)酵葡萄糖和木糖的微生物進行聯(lián)合發(fā)酵制備燃料乙醇。以往報道稱水解液中的單糖類，除了葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)率較高外，其它糖類尤其是木糖發(fā)酵產(chǎn)率較低，再加上發(fā)酵抑制物的影響；使得纖維素類生物質(zhì)制燃料乙醇很難實現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，其生產(chǎn)工藝整體上處于研發(fā)階段，工藝過程優(yōu)化是重要的研究方向之一。
試驗采用微波輔助稀酸預(yù)處理玉米芯以除去原料中半纖維素、果膠、色素和灰分等，并降低纖維素的結(jié)晶度，然后添加纖維素酶和釀酒酵母進行同步糖化發(fā)酵制備燃料乙醇，考察底物濃度、加酶量、溫度、接種量以及分批補料方式對同步糖化發(fā)酵的影響，建立同步糖化發(fā)酵工藝的最佳工藝條件。
1材料與方法
1.1原料與試劑
玉米芯取自河北成安縣，其主要成分為半纖維素38.89%、纖維素35.78%、水分8.032%，其他為木質(zhì)素及少量灰分。取風(fēng)干破碎（粒度<1 mm）玉米芯，加入2%稀H2SO4，液固比10：1(m L/g)，微波功率540W條件下處理16 min，冷卻后過濾，濾液用于制備木糖木糖醇，濾渣用去離子水洗滌至中性后烘干備用；熱帶假絲酵母（Candida tropicalis Berkhout）：中國微生物菌種保藏中心；纖維素酶( 40 000 U/g，在50℃，pH為5.0條件下，每分鐘水解纖維素產(chǎn)生1μg還原糖所需要的酶量定義為1個酶活力單位）：諾維信生物技術(shù)有限公司。
1.2主要儀器與設(shè)備
WBFY-205型可調(diào)功率微波化學(xué)反應(yīng)器：河南鞏義市予華有限責(zé)任公司；HZQ-F160型全溫振蕩培養(yǎng)箱：哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；SW-CJ-2F雙人雙面凈化工作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司；YX-18LDJ手提式壓力蒸汽滅菌器：江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司；UV1102紫外一可見分光光度計：上海天美科學(xué)儀器有限公司；800型電動離心沉淀器；等。
1.3方法
1.3.1配制培養(yǎng)基
菌種保藏培養(yǎng)基（麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基）：麥芽膏粉130 g/L，瓊脂15 g/L，氯霉素0.1 g/L，1 15℃滅菌30min，分裝在試管中（1/4試管體積），傾斜凝固制成斜面。
種子液體培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，酵母提取物10g/L，蛋白胨20 g/L，裝液量50 mU250 m L錐形瓶，115℃滅菌30 min。
發(fā)酵培養(yǎng)基：適量酸處理后玉米芯固體濾渣，酵母提取物2 g/L，硫酸銨8 g/L，磷酸二氫鉀2 g/L，七水硫酸鎂0.2 g/L，裝液量50 m L/250 m L錐形瓶，調(diào)pH5.0，115℃滅菌30 min。
1.3.2干酵母的活化
用無菌水將凍干管中的干酵母取出轉(zhuǎn)接到菌種保藏培養(yǎng)基斜面上，于30℃條件下培養(yǎng)2d，活化2次。
1.3.3種子液的制備
從斜面培養(yǎng)基上取一環(huán)經(jīng)兩次活化后的酵母接種到裝有種子液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，30℃，150 r/min振蕩培養(yǎng)36 h，得到種子液待用。
1.3.4同步糖化發(fā)酵
取種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基，并添加適量纖維素酶，于一定溫度下振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速控制在150 r/min。每隔12 h取樣，3 000 r/min離心5 min，取上清液測定乙醇含量�？疾斓孜餄舛�、加酶量、溫度、接種量以及分批補料方式對同步糖化發(fā)酵的影響。
1.3.5乙醇濃度測定
采用比色法進行測定，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量。
2結(jié)果與討論
2.1底物濃度對同步糖化發(fā)酵的影響
依次控制發(fā)酵培養(yǎng)基中玉米芯濾渣添加量為5，7.5, 10, 12.5和15 g，調(diào)pH 5.0，115℃滅菌30 min。冷卻后添加1%纖維素酶（相對于玉米芯濾渣干物料），體積分數(shù)5%酵母種子液，150 r/min．30℃振蕩培養(yǎng)60 h，每12 h取樣分析，發(fā)酵液中乙醇濃度見圖1。由圖中可以看出，發(fā)酵液中乙醇濃度隨發(fā)酵時間和底物濃度的增大而上升。底物濃度為30 g/100 m L時，乙醇濃度在發(fā)酵48 h后達到最高，為30.23 g/L，但物料轉(zhuǎn)化率較低。從圖中還可以看出，底物濃度低于20 g/100 m L時，物料轉(zhuǎn)化率隨發(fā)酵時間延長變化不明顯，但底物濃度大于20 g/100 m L時，轉(zhuǎn)化率開始下降。原因是底物濃度過高時，發(fā)酵環(huán)境較黏稠，不利于酶、底物、產(chǎn)物的擴散，也不利于系統(tǒng)中熱傳遞，從而影響酶解及發(fā)酵效率。相比5種底物濃度發(fā)酵情況，20 g/100 m L的乙醇轉(zhuǎn)化率最高，且在36 h發(fā)酵達到終點，比底物濃度30 g/100 m L的發(fā)酵周期短12 h。因此，綜合考慮發(fā)酵液中乙醇濃度、發(fā)酵周期和底料的轉(zhuǎn)化率，選擇同步糖化發(fā)酵的最適宜底物濃度為20g/100 m L，發(fā)酵36 h后乙醇濃度達到22.83 g/L，此時轉(zhuǎn)化率最高。
2.2加酶量對同步糖化發(fā)酵的影響
控制發(fā)酵液底物濃度為20 g/100 m L，培養(yǎng)時間48h，其他發(fā)酵條件不變，考察纖維素酶添加量分別為0.5%．1%，1.5%，2%和2.5%時對乙醇生成和底料轉(zhuǎn)化率的影響，結(jié)果見圖2。由圖2可知發(fā)酵24 h之內(nèi)，隨著加酶量的增大，酵母利用葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)生乙醇的量增大，底物轉(zhuǎn)化率也隨之升高。原因是加酶量對酶促反應(yīng)影響很大，加酶量不足，底物不能充分水解，導(dǎo)致酵母可利用的葡萄糖不足，而且隨酶解時間的推移，酶會逐漸失活。24 h之后加酶量為2%和2.5%產(chǎn)生乙醇的量沒有明顯區(qū)別，說明2%纖維素酶已是充足的加酶量，繼續(xù)添加會導(dǎo)致浪費�？紤]到玉米芯制備燃料乙醇的成本，纖維素酶的使用占較大比例，故在滿足生產(chǎn)要求的前提下，酶的添加量越少越好。所以選擇2%作為最佳纖維素酶添加量，發(fā)酵36 h乙醇濃度達到27.95 g/L。
2.3培養(yǎng)溫度對同步糖化發(fā)酵的影響
采用纖維素酶添加量為2%，同步糖化其他條件不變，考察培養(yǎng)溫度分別為27 ℃，30℃，33℃，36℃和39 ℃時乙醇生成和底料轉(zhuǎn)化率的情況。由圖3中可見，培養(yǎng)溫度對乙醇濃度影響很大，低溫和高溫都不利于乙醇的生成，原因是酶解糖化和發(fā)酵兩個過程所需的最佳溫度不一致。一般纖維素酶的最佳酶解溫度為50℃，遠遠高于釀酒酵母的使用溫度27℃～30℃，過高溫度會導(dǎo)致酵母降低活性甚至失活而無法對糖類進行發(fā)酵，這表現(xiàn)在圖3中培養(yǎng)溫度為39℃ 曲線上，導(dǎo)致酶解產(chǎn)生的葡萄糖不能及時轉(zhuǎn)化成乙醇。過低溫度又會影響纖維素酶的活性，降低了產(chǎn)糖速率，使釀酒酵母無法最大限度的利用糖類進行發(fā)酵，表現(xiàn)在圖3中培養(yǎng)溫度為27℃曲線上。從圖3中不同溫度下發(fā)酵結(jié)果來看，30 ℃和33℃培養(yǎng)條件下發(fā)酵情況較好，發(fā)酵36 h發(fā)酵溶液中乙醇的濃度分別為28.56 g/L和29.43 g/L。所以在不影響酵母生長的前提下，盡可能提高同步糖化的溫度。故選擇33℃為最佳同步糖化發(fā)酵溫度。
2.4接種量對同步糖化發(fā)酵的影響
控制同步糖化發(fā)酵溫度為33℃，其他條件不變，考察接種量分別為體積分數(shù)2.5%，5%，7.5%．10%和12.5%時乙醇生成和底料轉(zhuǎn)化率的情況，結(jié)果見圖4．由圖中可以看出，接種量對發(fā)酵液中乙醇濃度及發(fā)酵周期影響較大。接種量太小，酵母發(fā)酵速度緩慢，隨著發(fā)酵時間延長，酵母活力會下降，不利于乙醇的生成，且發(fā)酵周期也會延長，體現(xiàn)在圖4中2.5接種量曲線上。接種量過大會增加成本支出，且?guī)氪x廢物增多，不利于發(fā)酵反應(yīng)。綜合考慮發(fā)酵周期和乙醇濃度對接種量的要求，比較幾條接種量曲線可以看出，接種量為10%時發(fā)酵48 h所獲得乙醇濃度最大為30.98 g/L，故選擇接種量為10%為同步糖化發(fā)酵發(fā)酵最適接種量。
2.5分批補料對同步糖化發(fā)酵的影響
高纖維素底物濃度是生產(chǎn)高濃度乙醇的必要條件。由2.1分-析結(jié)果可知底物濃度過高不利于同步糖化發(fā)酵進行，分批補料工藝可有效緩解高底物濃度乙醇發(fā)酵的問題，即將底料玉米芯濾渣按不同時間點分批次填加到發(fā)酵體系中，使發(fā)酵液維持在較小的黏度，有利于系統(tǒng)中傳質(zhì)和傳熱過程的進行。試驗中設(shè)計分批補料方式按表1進行，四種補料方式最終底物總濃度均為30 g/100 m L，接種量為10%，其他條件不變，發(fā)酵過程中每12 h取樣分析乙醇濃度，結(jié)果見圖5。由表1和圖5可見，a組和b組添加的初始物料濃度均為20g/100 m L的條件下，36 h之前，a組比b組發(fā)酵液中乙醇濃度偏高，但終點乙醇濃度b組高于a組分別為37.24g/L和35.42 g/L。同樣對比c組和d組添加初始物料濃度均為15 g/100 m L，50 h之前，c組比d組發(fā)酵液中乙醇濃度偏高，但發(fā)酵到60 h，發(fā)酵液中終點乙醇的濃度分別達到39.56 g/L和41.23 g/L，且均高于前兩組補料方式，說明增加分批補料次數(shù)和分散補料時間有利于乙醇的生成，和辛崇博等的研究結(jié)論一致。相比于直接用底物濃度為30 g/100 m L的玉米芯濾渣發(fā)酵，分批補料工藝大大提高了終點乙醇濃度，有利于燃料乙醇的工業(yè)化生產(chǎn)，但高底物濃度在底物轉(zhuǎn)化率方面表現(xiàn)出劣勢，稍低于底物濃度為20 g/100 m L時的底物轉(zhuǎn)化率，而且發(fā)酵周期比不分批進料工藝延長了12 h。
3結(jié)論
采用微波輔助條件下稀酸預(yù)處理玉米芯，以除去原料中半纖維素、果膠、色素和灰分等，降低纖維素的結(jié)晶度。所得玉米芯濾渣中添加纖維素酶和釀酒酵母進行同步糖化發(fā)酵制備燃料乙醇，考察了底物濃度、加酶量、培養(yǎng)溫度、接種量以及分批補料方式對同步糖化發(fā)酵的影響，建立了同步糖化發(fā)酵工藝的最佳工藝條件：利用熱帶假絲酵母種子液接種，發(fā)酵底物濃度20 g/100 m L，纖維素酶添加量為2%（相對于干物料），接種量為10%，150 r/min，33℃振蕩培養(yǎng)48h，終點乙醇產(chǎn)量達到30.98 g/L。采用分批補料方式底物濃度提高到30 g/100 m L，其他條件不變培養(yǎng)60 h，終點乙醇產(chǎn)量達到41.23 g/L。上述工藝條件的建立為實現(xiàn)秸稈類農(nóng)業(yè)廢棄物綜合利用的工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)提供理論依據(jù)和技術(shù)指導(dǎo)。
下一篇:返回列表
