兩種酶制劑聯(lián)合分步酶解低值蝦的研究
李靜1，鄧毛程1*，王瑤1，劉嘉俊1，陸志鴻2
1．廣東輕工職業(yè)技術學院（廣州510300）；2．廣州市味研生物工程科技有限公司（廣州511300）
摘要為了利用低值蝦生產(chǎn)應用于食品工業(yè)領域的低分子肽，試驗研究了低分子肽酶解制取工藝。以低值蝦為底物，分別利用中性蛋白酶和風味蛋白酶在最適合的條件下制取低分子肽(360～2 500 D a)，目標產(chǎn)物分別呈現(xiàn)較強苦味和較弱苦味，最大得率分別為31.85%和20.45%。以中性蛋白酶的產(chǎn)物為底物，利用加酶量為2 000 U/g的風味蛋白酶進一步酶解，酶解-2 h達到良好的脫苦效果，產(chǎn)物得率為25.23%，表明兩種酶制劑聯(lián)合分步酶解工藝有利于獲得
較大量的、苦味較弱的目的產(chǎn)物。
關鍵詞低值蝦：低分子肽；酶解；苦味去除
我國是蝦類生產(chǎn)大國，每年產(chǎn)量都在100萬t以上。捕撈獲得的小蝦，或加工過程產(chǎn)生的下腳料，統(tǒng)稱為低值蝦，約占總產(chǎn)量40%以上。低值蝦富含蛋白質，但以簡單加工方式難以從中獲得人們食用的蛋白質產(chǎn)品，通常被用于生產(chǎn)蝦醬或生產(chǎn)動物飼料。為了提高蛋白資源的利用價值，研究人員致力于利用低值蝦開發(fā)氨基酸、活性肽和調味基料等產(chǎn)品，其中，應用于食品領域的熱點產(chǎn)品是具有呈味、易吸收等特性的低分子肽。但是，肽鏈長短、氨基酸組成及排列等直接影響低分子肽的呈味，在酶解制取特定分子范圍的肽類產(chǎn)品時，得率偏低是目前存在的主要問題。同時，由于酶解作用，疏水氨基酸的暴露導致低分子肽呈現(xiàn)苦味，影響低分子肽在食品領域的應用。試驗利用低值蝦制取低分子肽，側重于提高低分子肽的得率和脫除其苦味，以期為低值蝦的綜合利用提供有價值的參考。
1材料與方法
1.1材料
低值蝦（蛋白含量56.12%）：深圳市觀賞魚飼料有限公司；中性蛋白酶( 6.0×104 U/g)、堿性蛋白酶（2.0×105 U/g）：北京奧博星生物科技有限公司；風味蛋白酶( 1.5×104 U/g)：諾維信（中國）生物技術有限公司；木瓜蛋白酶（1.0×106 U/g）：廣西龐博生物工程有限公司；胰蛋白酶（1.0×104 U/g）：江蘇富盛德生物工程有限公司；其它試劑：分析純，市售。
1.2主要儀器與設備
PHS-2S型pH計：上海儀電科學儀器股份有限公司；DMF-10A型搖擺式高速粉碎機：浙江溫嶺市銘大藥材機械設備有限公司；SHA-2型水浴恒溫振蕩器：金壇市瑞華儀器有限公司；KDC-210HR型高速冷凍離心機：安徽中科中佳科學儀器有限公司；LNG-UF-101型超濾機：上海朗極膜分離設備工程有限公司：VFB-1000型真空冷凍干燥機：上海比朗儀器制造有限公司；L-8800型氨基酸自動分析儀：日本日立公司。
1.3酶制劑的優(yōu)選
將低值蝦干粉碎，過100目篩，稱取20 g粉體，加入純凈水使液固比達30：1（m L/g），分別加入中性蛋白酶、堿性蛋白酶、風味蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶，加酶量為2 000 U/g（蛋白質），分別在各種酶制劑的最適pH和最適溫度下進行酶解10 h。酶解后，于10 000 r/min的條件下離心15 min，取清液，測定氨基酸態(tài)氮，并計算蛋白質水解度，據(jù)此優(yōu)選酶制劑。參照文獻計算蛋白質水解度。
1.4酶制劑用量的優(yōu)選
利用優(yōu)選酶制劑和使用不同的酶量，在酶解過程中，每隔1h測定酶解液的氨基酸態(tài)氮，并計算蛋白質水解度，據(jù)此優(yōu)選酶制劑用量。
1.5低分子肽酶解制取
按最佳用量的投入單一酶制劑，在特定時間下進行酶解，利用超濾裝置對酶解液進行分離，收集分子量為360～2 500 D a的濃縮液，經(jīng)冷凍干燥，稱其質量，計算低分子肽的得率，并感官評定低分子肽的苦味。低分子肽的得率按公式(2)計算。
1.6聯(lián)合酶解去除苦味
在1.5試驗基礎上，將得率最高的低分子肽配制成溶液（液固比30：1 m L/g），加入風味蛋白酶，加酶量為2 000 U/g，在pH 6.5、50 ℃的條件下進行酶解脫苦，酶解反應時間分別為30，60，90，120，150，180，210和240 min。利用氨基酸分析儀測定溶液中酶解前、后的游離氨基酸。然后，按1.5所述方法，獲得分子量為360～2 500 D a的干燥產(chǎn)物，計算低分子肽的得率和評定低分子肽的苦味。
1.7低分子肽苦味評價
將低分子肽配制成30 g/L的樣液，由7名有經(jīng)驗人員組成評定小組對其苦味進行評定，評定方法參照文獻的感官分析方法。以硫酸奎寧溶液為標準對照物，分別配制成1.28×10-4，0.64×10-4，0.32×10-4，0.16×10-4, 0.08×10-4和0.04×10-4 mol/L溶液，分別對應的苦味強度和苦味值：苦味很強，苦味值為5；苦味強，苦味值為4；苦味較強，苦味值為3；苦味較弱，苦味值為2；苦味微弱，苦味值為1；無苦味，苦味值為0。依據(jù)感官評定程序，比較樣液與標準液的苦味，以苦味相近原則確定樣液的苦味值。
1.8測定方法
利用氨基酸自動分析儀測定樣品的游離氨基酸。測定前，先將溶液于12 000 r/min的條件下離心20 min，取清液，過膜（0.22μ m），然后上機檢測，檢測條件。酶解液中氨基酸態(tài)氮的測定采用甲醛滴定法。低值蝦的總氮測定采用微量凱氏定氮法。蛋白酶活力的測定采用Fo lin試劑法，酶活力單位定義為每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1μ g酪氨酸的酶量，以U
表示。
2結果與分析
2.1不同酶制劑的酶解能力
以不同蛋白酶對低值蝦進行酶解，蛋白質的水解度如圖1所示。蛋白質的氨基酸組成和排列對蛋白酶的酶解作用有影響，不同蛋白酶對同一底物的水解效果有差異。以低值蝦的蛋白質為底物，中性蛋白酶的酶解作用最強，其次是風味蛋白酶。在最適條件下，中性蛋白酶和風味蛋白酶的水解度分別為45.41%和40.66%，可優(yōu)選為進一步研究的酶制劑。
2.2不同加酶量的酶解能力
分別以不同用量的中性蛋白酶和風味蛋白酶進行酶解試驗，水解度分別如圖2和圖3所示。隨著加酶量增大，兩種蛋白酶的水解能力呈增強趨勢。當中性蛋白酶和風味蛋白酶的用量分別增加至3 000 U/g和4 000U/g，在7h的水解度接近最大值，繼續(xù)增大加酶量，或繼續(xù)延長時間，水解度增大不明顯。從節(jié)約酶制劑用量和水解時間考慮，中性蛋白酶和風味蛋白酶的最適用量分別優(yōu)選為3 000 U/g和4 000 U/g。
2.3不同時間的產(chǎn)物得率和苦味分析
分別在中性蛋白酶和風味蛋白酶的最適加酶量下進行酶解，分子量為360～2 500 D a的低分子肽的得率和苦味值如圖4和圖5所示。在中性蛋白酶作用過程中，低分子肽的得率先呈逐步上升趨勢，在酶解4h達到最高值(31.85%)，爾后又逐步下降。與中性蛋白酶相比，風味蛋白酶產(chǎn)生低分子肽的得率要低很多，其最大得率僅為20.45%．出現(xiàn)在酶解5h。但是，中性蛋白酶是內切酶，它能夠隨機切斷肽鏈任意肽鍵位置，有可能使較多疏水氨基酸暴露于肽鏈兩端，致產(chǎn)物呈較強苦味，苦味值為3.7。風味蛋白酶是內切酶和外切酶的混合物，由于外切酶可以水解肽鏈末端釋放疏水氨基酸，故酶解產(chǎn)物的苦味值僅為1.6。基于中性蛋白酶和風味蛋白酶各自的優(yōu)點，有必要聯(lián)合利用這兩種酶制劑進行分步酶解試驗，以同時獲得較高的產(chǎn)物得率和較弱的苦味。
2.4聯(lián)合酶解的產(chǎn)物得率和苦味分析
收集中性蛋白酶酶解產(chǎn)生的低分子肽，利用風味蛋白酶繼續(xù)酶解，低分子肽的得率和苦味值如圖6所示。由于酶制劑中外切酶和內切酶的同時作用，隨著水解時間的增加，目標產(chǎn)物得率和苦味值均呈下降趨勢。從苦味去除效果來看，在風味蛋白酶繼續(xù)作用2h后，低分子肽的苦味值降低至1.9以下，接近風味蛋白酶單獨酶解的結果。從低分子肽的得率來看，在風味蛋白酶繼續(xù)作用2～3 h期間，得率均高于風味蛋白酶單獨酶解的得率。結果表明，采用兩種酶制劑分步酶解，有利于保持較高的產(chǎn)物得率和有效降低產(chǎn)物的苦味值。聯(lián)合酶解的實際意義在于盡可能保持較高的產(chǎn)物得率，故選擇風味蛋白酶繼續(xù)作用的時間為2h，此
時的得率和苦味值分別為25.23%和1.9。
2.5游離氨基酸的分析
利用加酶量為2 000 U/g的風味蛋白酶對中性蛋白酶酶解產(chǎn)物進行脫苦，脫苦前后游離氨基酸變化情況如表1所示。經(jīng)過風味蛋白酶水解2h，低分子肽溶液中游離氨基酸的增加幅度較大，增加總量達7 714.28 g/L。在游離氨基酸中，疏水氨基酸所占比例為44.40%，其中，亮氨酸、異亮氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸和纈氨酸等疏水氨基酸增加量較大。游離氨基酸分析結果表明，風味蛋白酶可以水解釋放大量的疏水氨基酸，使對中性蛋白酶酶解產(chǎn)物的苦味大幅度減弱。
3結論
中性蛋白酶和風味蛋白酶對低值蝦都具有較強的水解能力，它們的最佳加酶量為3 000 U/g和4 000 U／g。分別利用中性蛋白酶和風味蛋白酶在最適合的條件下制取低分子肽( 360～2 500 D a)，目標產(chǎn)物分別在酶解4h和5h獲得，得率分別為31.85%和20.45%，分別呈現(xiàn)較強苦味和較弱的苦味。以中性蛋白酶的產(chǎn)物為底物，利用加酶量為2 000 U/g的風味蛋白酶進一步酶解脫苦，酶解2h的產(chǎn)物得率為25.23%，產(chǎn)物苦味較弱，此時酶解液中游離氨基酸增量為7 714.28 g／L，其中疏水氨基酸占44.40%。結果表明，利用兩種酶制劑進行聯(lián)合分步酶解，可以在較高的得率水平基礎上獲得苦味較弱的目的產(chǎn)物。研究結果可為低值蝦工業(yè)化生產(chǎn)低分子肽提供有價值的參考。
