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 賈氏臣，趙樹欣*

 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院（天津300457）

摘要紅曲菌生產(chǎn)的紅曲黃色素，已經(jīng)被證明是良好的抗炎癥、抗腫瘤、抗動(dòng)脈粥樣硬化和抗肥胖藥物。但是有毒的物質(zhì)橘霉素也在紅曲茵發(fā)酵過程中產(chǎn)生。在試驗(yàn)中，通過添加抗氧化劑利用固態(tài)發(fā)酵優(yōu)化紅曲菌FJ3高產(chǎn)紅曲黃色素，同時(shí)降低橘霉素產(chǎn)量。在選用的4種抗氧化劑中，半胱氨酸和植酸鈣對黃色素具有良好的促進(jìn)作用，維生素C、植酸鈣和乳酸鈣對橘霉素具有良好的抑制作用。通過正交試驗(yàn)優(yōu)化各個(gè)抗氧化劑的添加量，在維生素C、半胱氨酸、植酸鈣和乳酸鈣的添加量分別為16.0，6.0，1.4和8.0 g/kg時(shí)，黃色素的產(chǎn)量達(dá)最大，為2 988 U/g(優(yōu)化前的6.80倍)，色調(diào)為1.39（優(yōu)化前的1.45倍），同時(shí)橘霉素產(chǎn)量為0.017 6 mg/g(優(yōu)化前的約1/2)。

關(guān)鍵詞紅曲菌；黃色素；抗氧化劑；固態(tài)發(fā)酵；正交試驗(yàn)

 紅曲菌可以生產(chǎn)多種生物活性物質(zhì)，紅曲色素就是其中重要的一種，紅曲色素可以分為紅、橙、黃三種色素，最基本的有6種，隨后又發(fā)現(xiàn)了50多種。

 紅曲黃色素-Monascin(MS)和Ankaflavin( AK)，具有很多的生理功能，比如抗炎癥、抗癌癥、抗氧化、抗肥胖和抗糖尿病，還可以通過降低總膽固醇、甘油三酸酯和低密度脂蛋白的水平量降低血脂。

 Wei-Hsuan Hsu等研究表明MS可以在腫瘤壞死因子a-TNF處理的C2C12肌小管中通過減少氨基末端激酶(JUN)磷酸化和抑制過氧化物酶體增殖物激活受體y( PPARy)磷酸化，來提高胰島素敏感度，并且還可通過抑制蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化1B( PTPIB)的表達(dá)來減少胰島素耐受性，使葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體( GLUT)移動(dòng)到細(xì)胞膜上，隨后促進(jìn)葡萄糖的攝取，從而起到抗糖尿病的效果。AK可以控制一些轉(zhuǎn)錄因子，比如PPAR-r．PPAR-a和Nrf2，來阻止代謝綜合癥和其他疾病。AK通過激活PPAR-r和PPAR-a提高脂類物代謝作用，增加胰腺功能來降低高血糖癥。MS和AK可以防止前脂肪細(xì)胞的增殖，分化和促進(jìn)成熟脂肪細(xì)胞的基礎(chǔ)分解，從而避免脂質(zhì)的累積。

 如圖1從紅曲色素的代謝途徑可以看出，色素在紅曲菌中首先合成橙色素，橙色素通過轉(zhuǎn)氨作用生成紅色素，同時(shí)橙色素還可以通過還原反應(yīng)生成黃色素，因此添加抗氧化可以通過提供氧供體，使得橙色素更有利于流向黃色素，從而增加黃色素的產(chǎn)量。

目前，針對抗氧化對紅曲色素的研究，主要集中在對色素的保護(hù)作用上，研究抗氧化劑在發(fā)酵過程中對色素生成影響的非常少。根據(jù)GB 2760-2014食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)選取抗氧化劑，研究了它們在紅曲色素固態(tài)發(fā)酵過程中對色素及橘霉素代謝生成的影響。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1菌株

 紅曲菌FJ3為天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院保藏菌種。

1.1.2培養(yǎng)基

 菌株活化培養(yǎng)基：麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基：13 0Bx的麥芽汁，瓊脂粉2%；液態(tài)種子培養(yǎng)基：5%大米粉培養(yǎng)基，pH自然；固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：30 g秈米/250 m L_角瓶，加水浸泡12 h，淋水調(diào)節(jié)含水量至35%。

1.1.3試劑

 抗壞血酸：天津市化學(xué)試劑一廠；L-半胱氨酸：天津市福晨化學(xué)試劑廠；植酸鈣：成都化夏化學(xué)試劑有限公司；乳酸鈣：北京化工廠；橘霉素標(biāo)準(zhǔn)品：Sigma公司；乙腈：賽默飛世爾科技有限公司；其他均為分析純級別。

1.1.4儀器

 Agilent 1200 series高效液相色譜儀：安捷倫科技有限公司，MJ-Ⅱ霉菌培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限公司，電子分析天平：奧豪斯儀器（常州）有限公司，UV5100型紫外可見分光光度計(jì)：日本島津公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1  菌種培養(yǎng)和發(fā)酵條件

 種子：接種孢子懸液1 m L，30℃110 r/min培養(yǎng)48 h；發(fā)酵：10%的接種量接人種子液，30℃，65%的濕度下培養(yǎng)6d。

1.2.2發(fā)酵產(chǎn)物的測定

 色價(jià)根據(jù)GB 4926-2008中紅曲色素的測定方法進(jìn)行測定；橘霉素根據(jù)GB/T 5009.222-2008紅曲類產(chǎn)品中橘霉素的測定方法進(jìn)行測定。

2結(jié)果與討論

2.1維生素C對FJ3固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物的影響

 維生素C是一種常見的水溶性抗氧化劑。白色或略帶淡黃色結(jié)晶或結(jié)晶性粉末，無臭，有酸味，易溶于水。試驗(yàn)中維生素C的梯度添加量為0，5，10，15和20 g/kg，所得數(shù)據(jù)見圖2。

 從圖2中可以看出隨著維生素C添加量的增加，色素的產(chǎn)量表現(xiàn)出先增加后減小的趨勢，在添加量在15g/kg達(dá)到最大。此時(shí)，黃色素的色價(jià)最高，其次是紅色素，最低的是橙色素，三種色素分別是空白對照組的2.83，3.05和3.17倍。增加幅度很大。同時(shí)此時(shí)橘霉素的產(chǎn)量也有明顯的降低，是對照組的1/3。選定維生素C的中心點(diǎn)添加量為15 g/kg。

2.2半胱氨酸對FJ3固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物的影響

 半胱氨酸是無色至白色細(xì)柱狀結(jié)晶或粉末，有輕微特殊氣味和滋味溶于水。試驗(yàn)中半胱氨酸的梯度添加量為0，5，10，15和20 g/kg，所得數(shù)據(jù)見圖3。

 從圖3中可以看出，隨著半胱氨酸添加量的增加，色素的產(chǎn)量先增加后降低，在添加量為5 g/kg時(shí)達(dá)到最大。此時(shí)，三種色素的色價(jià)黃色最高，紅色次之，橙色最小，分別是空白對照組的2.90，2.14和2.63倍，黃色價(jià)增加幅度很大，添加半胱氨酸有利于增加黃色素的產(chǎn)量。同時(shí)橘霉素的產(chǎn)量也有1.40倍的增加，但是增加幅度沒有色素的大，可以在進(jìn)行添加量的優(yōu)化來平衡它們。選擇半胱氨酸的中心點(diǎn)添加量為5 kg。

2.3植酸鈣對FJ3固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物的影響

 植酸鈣為白色粉末，可作為營養(yǎng)藥，有促進(jìn)新陳代謝，增進(jìn)食欲和營養(yǎng)，助長發(fā)育等作用。試驗(yàn)中植酸鈣的梯度添加量為0，0.5，1.0，1.5和2.0 g/kg，所得數(shù)據(jù)見圖4。

 從圖4中可以看出隨著植酸鈣添加量的增加，色素的產(chǎn)量表現(xiàn)出現(xiàn)逐漸增加的趨勢，在1.0 g/kg時(shí)達(dá)到穩(wěn)定，此時(shí)，紅橙黃三種色素的產(chǎn)量分別是空白組的3.94, 4.65和5.06倍，黃色素產(chǎn)量的增加速率要高于紅橙兩種色素，這就說明添加植酸鈣有利于紅曲菌固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)黃色素。同時(shí)，添加植酸鈣對橘霉素的產(chǎn)量也會(huì)有明顯的抑制作用，是對照組的1/3，選定植酸鈣的中心添加量為1.0 g/kg。2.4乳酸鈣對FJ3固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物的影響乳酸鈣，白色至乳白色結(jié)晶或粉末，基本無臭無味。易溶于熱水成透明或微混濁的溶液。試驗(yàn)中乳酸鈣的梯度添加量為0，5，10，15和20 g/kg，所得數(shù)據(jù)見圖5。

 從圖5中可以看出隨著乳酸鈣添加量的增加，色素的產(chǎn)量表現(xiàn)出先增加后減小的趨勢，當(dāng)乳酸鈣的添加量在5 g/kg達(dá)到最大。此時(shí)，紅、橙和黃三種色價(jià)中，紅色素的色價(jià)最高，其次是黃色素最低的是橙色素，三種色素分別是空白對照組的1.66，1.68和1.64倍。增加幅度很大。同時(shí)此時(shí)橘霉素的產(chǎn)量也有明顯的降低，是對照組的1/2，選擇乳酸鈣的中心添加量為5 g/kg。

2.5正交試驗(yàn)

 根據(jù)單因素試驗(yàn)得到各個(gè)因素的中心點(diǎn)，再加上一個(gè)空白因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，因素水平表見表1，試驗(yàn)數(shù)據(jù)及直觀分析見表2，方差分析見表3。

 從表2直觀分析表中可以看出，對黃色價(jià)、黃色調(diào)和橘霉素產(chǎn)量影響的順序?yàn)榘腚装彼?B)>乳酸鈣(D)>維生素C(A)>植酸鈣(C)，表3中可以看出，除了半胱氨酸對黃色素產(chǎn)量和黃色調(diào)具有顯著的影響(p<0.10)外，其他因素都對黃色素和黃色調(diào)影響菌不顯著，所有因素對橘霉素影響均不顯著。但是橘霉素的產(chǎn)量均比未優(yōu)化前降低很多，降低倍數(shù)在1.79～4.36倍。根據(jù)直觀分析表影響色價(jià)最優(yōu)添加方案為A4B1C4D4，影響色調(diào)最優(yōu)添加方案為A2B4C4D1。

 從顯著性分析中可以看出，半胱氨酸是影響色價(jià)和色調(diào)的關(guān)鍵因素，同時(shí)兩者又是一個(gè)矛盾的，

 比較色價(jià)、色調(diào)和橘霉素的產(chǎn)量來看可以得出在添加方案為A4B3C4D4時(shí)達(dá)到最好。此時(shí)維生素C、半胱氨酸、植酸鈣和乳酸鈣的添加量分別為16.0，6.0，1.4和8.0 g/kg，黃色素的產(chǎn)量達(dá)到2 988 U/g（優(yōu)化前的6.80倍），色調(diào)為1.39（優(yōu)化前的1.45倍），橘霉素為0.017 6 mg/g（優(yōu)化前的約1/2）。

3結(jié)論

 1)在紅曲固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，添加食品中允許添加的抗氧化劑，有利于紅曲黃色素的積累，同時(shí)還可以有效地抑制橘霉素的產(chǎn)量。通過單因素試驗(yàn)可以得到半胱氨酸和植酸鈣對黃色素具有良好的促進(jìn)作用，而維生素C和乳酸鈣對橘霉素具有良好的抑制作用。

 2)通過正交試驗(yàn)可以得到培養(yǎng)基中添加維生素C16.0 g/kg，半胱氨酸6.0 g/kg，植酸1.4 g/kg，乳酸8.0g/kg時(shí)，黃色素的產(chǎn)量達(dá)到最大2988 U/g，是優(yōu)化前的6.8倍。色調(diào)為1.39，是優(yōu)化前的1.45倍。同時(shí)橘霉素的產(chǎn)量為0.017 6 mg/g，是優(yōu)化前的1/2。