鮟觫皮膠原蛋白肽最佳制備工藝及自由基清除活性研究
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邵宏宏，周秀錦，相興偉，張靜，傅謐妮
舟山出入境檢驗檢疫局（舟山316000）
摘要研究提取鮟鱇(Lophius litulon)膠原蛋白肽的最佳制備工藝，測定魚皮基本成分和多肽的氨基酸組成，探討鮟鱇膠原肽組分體外對自由基的清除效果。研究結(jié)果表明，魚皮中粗蛋白占28.1%，胃蛋白酶添加量1%，料液比1：20 (g/m L),酶解時間6h，酶解溫度5℃時，提取的鮟鱇魚皮膠原蛋白肽的H yp（羥脯氨酸）提取率為11.46%；鮟鱇魚皮膠原蛋白肽中Gl y（甘氨酸）占36.61%, Pro（脯氨酸）和H yp總含量占16.86%, P he（苯丙氨酸）、C ys（半胱氨酸）、His（組氨酸）三者含量不及1%；鮟鱇魚皮膠原蛋白肽具有較強的還原能力且對O2-.（超氧陰離子自由基）、. DPPH(二苯基苦酰肼自由基自由基）、. OH（羥自由基）自由基具有清除效果，且自由基清除能力隨著鮟鱇魚皮膠原蛋白肽的濃度升高而增強，鮟鱇魚皮膠原蛋白肽濃度為10 mg/m L時對．OH，DPPH．，O2-．的清除率和還原力分別為70.48%, 68.78%, 42.53%和0.676%。
關(guān)鍵詞 鮟鱇魚；膠原蛋白肽；氨基酸；自由基；抗氧化；羥脯氨酸
鮟鱇魚（Lophius litulon）屬冷溫性底層魚類，常棲伏海底，分布于北太平洋西部，我國產(chǎn)于東海北部、黃海及渤海。近年來我國鮟鱇魚出口需求旺盛，產(chǎn)量和價格大幅增加，鮟鱇魚出口已成為我國的新興漁業(yè)。然而，在鮟鱇魚的加工中，大量魚皮被做為下腳料而廢棄，這不僅污染環(huán)境，而且浪費資源。
研究證實人體內(nèi)氧化產(chǎn)生的自由基與人的衰老、癌癥、動脈硬化等許多疾病有關(guān)，其中尤以氧自由基最多，在機體內(nèi)過多的自由基可損傷生物大分子，影響細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)和功能。目前，已有研究報道水產(chǎn)動物提取多肽具有體內(nèi)外抗氧化活性，并顯示了具有較好應(yīng)用前景。
試驗研究了鮟鱇魚皮膠原蛋白肽對自由基的清除作用以及體外抗氧化作用，以探索實現(xiàn)鮟鱇皮的高值化加工利用途徑。以鮟鱇魚皮為原料，研究魚皮成分組成，通過正交試驗酶解制備鮟鱇魚皮膠原蛋白肽，分析膠原肽氨基酸組成。通過鐵離子還原體系和具有代表性的O2-．，DPPH．和．OH三種自由基體系的試驗，研究鮟鱇魚皮多肽體外對自由基的清除效果。
1 材料與方法
1.1材料與儀器
鮟鱇魚原料：由舟山興業(yè)有限公司提供，原料去肉，去除雜物，于-18℃冷藏；胃蛋白酶：比活力1：3 000，上海源聚科技生物有限公司；其他的試劑為國產(chǎn)分析純。
Micct-Q型超純水器：日本Milli-por LIMITED公司；EYELA冷凍干燥機：上海愛朗儀器有限公司；CR21G高速冷凍離心機：HITACHI CENTRIFUGE；AL-104電子分析天平：梅特勒一托利多儀器有限公司；日立835-50氨基酸自動分析儀：日本日立公司；UV-2102 C型紫外分光光度計：上海尤尼柯儀器有限公司；SK21-4型數(shù)顯水浴鍋：天津歐諾儀器公司；海爾冰箱：青島海爾股份有限公司。
1.2試驗方法
1.2.1魚皮基本組成成分測定
水分：直接干燥法測定；灰分：高溫爐550 0C灼燒法測定；粗蛋白：微量凱氏定氮法測定；粗脂肪：索氏脂肪抽提法測定；總糖：苯酚硫酸法測定。
1.2.2魚皮膠原蛋白肽的制備
11最佳胃蛋白酶添加量的確定：試驗固定料液比1：20( g/m L)，酶解時間6h，酶解溫度5aC，胃蛋白酶添加量分別取0.5%，7.0%，1.0%，1.5%，2.0%．2.5%和3.0%。
2)料液比的確定：試驗固定胃蛋白酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%，酶解時間6h，酶解溫度5℃，料液比分別取1：5,1: 10,1:20,1:25和1:30( g/m L).
3)酶解溫度的確定：試驗固定胃蛋白酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%，料液比1：20( g/m L)，酶解時間6h，酶解溫度1 ℃,5℃, 10℃,15℃,20℃和22℃。
41酶解時間的確定：試驗固定胃蛋白酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%，料液比1：20( g/m L)，酶解溫度50C，酶解時間1，2，3，4，5，6和7h。
5)魚皮膠原蛋白肽的制備條件：通過正交試驗，確定工藝流程。新鮮魚皮預(yù)處理（0.1 mol/L Na OH輔以磁力攪拌24 h，蒸餾水洗至中性，10%丁醇浸泡24 h，洗至中性）→0.5 mol/L醋酸浸提24 h→0.9 mol/L Na Cl鹽析24 h→蒸餾水透析(料液比為1：15(g／m L)) →沉淀得ASC→酶水解(胃蛋白酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%，料液比為1：20( g/m L )，酶解時間6h，酶解溫度5℃）→過濾→濃縮→產(chǎn)品凍干保存。
1.2.3羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
按照IS0 3496: 1978 (E)方法，略有修改。羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品用蒸餾水稀釋為1，2，2.5，3，3.5，4和4.5μg/m L，以對二甲基氨基苯甲醛為顯色劑，以羥脯氨酸的濃度為橫坐標(biāo)，測定不同濃度的羥脯氨酸的A560值為縱坐標(biāo)，繪制羥脯氨酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖1，羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)樣品的回歸方程為Y=11.710 8X-3.531 6(R2=0.995 3)。
1.2.4 H y p提取率計算
稱取1.0 g鮟鱇魚皮粉，加入50 m L濃度為6 mol/L的鹽酸，105 0C鼓風(fēng)干燥箱中密封水解24 h，用蒸餾水定容至100 m L。準(zhǔn)確移取1 m L該水解液，用Na OH溶液調(diào)節(jié)pH至6.0后蒸餾水定容至100 m L，按1.2.3方法測定羥脯氨酸含量，計算出魚皮中羥脯氨酸總含量，量取10 m L膠原蛋白提取液，按上述方法測定提取液中羥脯氨酸的含量，計算羥脯氨酸的提取率。
H yp提取率=提取液中H yp總含量(%)，魚皮原料中H yp總含量(%) (1)
1.2.5鮟鱇魚皮膠原蛋白肽的氨基酸組成測定
稱取一定量的凍干的鮟鱇魚皮多肽，加入6 mol/LHC1后真空封管，置110℃烘箱密封水解24 h后抽真空趕酸，定容至0.5 m L，氨基酸自動分析儀測定各氨基酸的含量，進樣量為50 μL。
1.2.6樣品的抗氧化能力
選取維生素C、茶多酚和BHA為對照樣品，體外試驗分別設(shè)置的濃度梯度為2，4，6，8和10 mg/m L。
1.2.6.1樣品的還原能力測定
取一定濃度的樣品，加入2.5 m L pH 6.6的磷酸鹽緩沖液( 0.2 mol/L)和2.5 m L體積分?jǐn)?shù)1%的鐵氰化鉀溶液，混勻，在50℃保溫20 min后加入2.5 m L 10%的三氯乙酸，混合后以3 000 r/min離心10 min。取上清液2.5 m L，加蒸餾水2.5 m L和0.5 m L，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的FeCl3，用A700nm波長處測定的比色值(ABS)表示樣品還原能力。
1.2.6.2樣品清除超氧陰離子自由基能力測定
采用鄰苯三酚自氧化法，鄰苯三酚在堿性條件下發(fā)生自氧化，生成有色中間產(chǎn)物和超氧陰離子自由基，超氧陰離子自由基對自氧化有催化作用。具體操作：取0.05 mol/L Tris-HCl pH 8.2緩沖液4.5 m L，置25 0C水浴預(yù)熱20 min，加0.1 m L不同濃度的樣品，2.5 m mol/L鄰苯三酚0.4 m L，混勻后在25℃水浴中反應(yīng)4 min，立即用VC溶液終止反應(yīng)，測A299nm值。以蒸餾水代替樣品做空白組，按式(2)計算清除率并求得IC50。
1.2.6.3樣品清除DPPH自由基能力測定
采用DPPH酶標(biāo)儀法，加不同濃度的樣品溶液100 μL和1 m mol/L的DPPH自由基甲醇溶液100 μL于96孔酶標(biāo)板中，振蕩30 s，37℃保溫20 min后在517nm波長下測定。每個樣品平行測定3次。然后按公式(3)計算。
代替樣品）的吸光度。
1.2.6.4樣品清除羥自由基能力測定
取0.025 mol/L，pH 7.4的磷酸緩沖液1 m L，40 μg/m L的番紅花紅1 m L，供試藥品0.5 m L，3%過氧化氫1 m L（新鮮配制），0.945 m mol/L EDTA-Fe(Ⅱ)1m L（新鮮配制），混合后37℃水浴中反應(yīng)30 min后，520 nm處測定吸光度�？瞻捉M以0.5 m L蒸餾水代替供試樣品，對照組以1.5 m L蒸餾水代替EDTA-Fe(Ⅱ)和供試樣品，按式(4)計算清除率。
2結(jié)果與分析
2.1鮟鱇魚皮基本組成成分
從表1可以看出，鮟鱇魚皮的水分含量很高，約占總重的70%。粗蛋白約占28%，約為干物質(zhì)總量的93%，粗脂肪的含量比粗蛋白相比較低。
2.2最佳處理條件的確定
2.2.1確定最佳胃蛋白酶添加量
當(dāng)胃蛋白酶添加量為0.5%時，膠原蛋白肽液中H y p的提取率最低，H y p的提取率隨著酶添加量的增加而增加，在添加量為1.5%時，H y p的提取率最大，隨后H y p的提取率下降，雖然胃蛋白酶添加量為1.5%時的 H y p提取率比1%時稍高，但酶用量較大。所以從純度和經(jīng)濟方面考慮，1%的胃蛋白酶添加量應(yīng)為最佳選擇，試驗結(jié)果如圖2所示。
2.2.2確定最佳料液比
當(dāng)料液比為1：20( g/m L)時提取效果最好。隨著料液比增加，魚皮中H y p的提取率增加，但到一定程度后，魚皮中H y p的提取率降低，故確定最佳料液比為1：20( g/m L)，試驗結(jié)果如圖3所示。
2.2.3確定最佳溫度
從圖4中可以看出，膠原蛋白肽在5℃時酶處理效果最好，提取效果最好，過高或過低的溫度都會影響酶的活性，從而影響酶處理效果，試驗結(jié)果如圖4所示。
2.2.4確定最佳時間
試驗結(jié)果如圖5所示，當(dāng)酶解時間為6h時提取效果最好。反應(yīng)初期，酶解速率較大，膠原蛋白肽液中H y p的提取率上升，但到達一定時間后，酶失去作用力，含量不再上升，故確定最佳酶解時間為6h。
2.3最佳提取條件的確定
由單因素試驗的結(jié)果，以酶解時間、料液比、胃蛋白酶加酶量和溫度為因素，H y p提取率為指標(biāo)設(shè)計L9(34)正交表，以確定最佳工藝。試驗結(jié)果見表2。
正交試驗極差(R)表明，對H y p影響最大的是酶解溫度(D)，依次是料液比(B)，加酶量
(C)，酶解時間(A)，最佳提取組合為A3B3C2D1，即胃蛋白酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%，料液比為1：20( g/m L)，酶解時間6h，酶解溫度5℃。
由表3可以看出，酶解溫度對提取的膠原蛋白肽的H y p含量具有極顯著影響，而料液比，酶解時間和加酶量有較小影響，優(yōu)選組合應(yīng)為A3B3C2D1，H y p含量為11.46%。
2.4氨基酸組成成分分析
最佳酶解提取工藝條件下，鮟鱇魚膠原蛋白肽的氨基酸組成和含量，如表4所示。
鮟鱇多肽的氨基酸組分中G l y、Pro和H y p等的與其性質(zhì)密切相關(guān)的氨基酸含量較高。與其他來源的魚皮膠原蛋白一樣，甘氨酸占36.61%，在鮟鱇膠原蛋白肽中含量最高，其中Pro和H y p的含量占16.86%，而P he、C y s和His含量極小，三者含量占有比例均不達1%。
2.5鮟鱇魚皮膠原蛋白肽的紫外吸收光譜
在200～400 nm的近紫外光區(qū)將提取的鮟鱇多肽進行全波長掃描，結(jié)果如圖6。由圖6可知，鮟鱇多肽在200～250 nm有紫外吸收，其最大的吸收波長為232nm。
2.6鮟鱇魚皮膠原蛋白肽的抗氧化能力
2.6.1 鮟鱇魚皮膠原蛋白肽的還原能力
在低pH下，抗氧化劑將Fe3+還原成藍色的Fe2+以Fe2+當(dāng)量或者相對于標(biāo)準(zhǔn)抗氧化劑的能力來表示抗氧化活性。
圖7為不同抗氧化劑（鮟鱇膠原蛋白肽，VC，BHT和茶多酚）對Fe3+的還原能力。相同濃度條件下，鮟鱇膠原蛋白肽的還原能力介于VC和BHT之間，VC的還原能力最高。室溫條件下，鮟鱇多肽的抗氧化活性隨濃度增大而增強。
2.6.2鮟鱇魚皮膠原蛋白肽清除超氧陰離子的能力
超氧陰離子是生物有機體代謝過程中產(chǎn)生氧化能力很強的自由基，為此可以測定抗氧化劑對其清除效率來表征樣品的抗氧化能力。各種抗氧化劑濃度與自由基的清除率關(guān)系如圖8可知，隨抗氧化劑濃度的增加而對超氧陰離子清除率增大，其中膠原蛋白肽濃度為10 mg/m L時清除率為42.53%。
2.6.3鮟鱇魚皮膠原蛋白肽清除DPPH自由基的能力
穩(wěn)定自由基DPPH．乙醇紫色溶液在517 nm波長有較強的吸收峰值，抗氧化劑能使這一吸收現(xiàn)象消失，顏色褪化，因此通過衡量樣品溶液吸光度的變化能夠快速靈敏的評價抗氧化劑的抗氧化能力。濃度不同的抗氧化劑清除DPPH自由基的結(jié)果如圖9所示，清除DPPH的能力均隨濃度的增加而增大，膠原蛋白肽濃度為10 mg/m L時清除率可達68.78%。濃度相同時，抗氧化劑清除能力的大小依次為茶多酚>VC>多肽>BHT，因此可知多肽具有一定的的清除DPPH能力。
2.6.4鮟鱇魚皮膠原蛋白肽清除羥自由基的能力
羥基自由基(．0H)是需氧生物代謝過程中生成的強氧化能力的氧自由基，因此以清除羥自由基能力來反應(yīng)抗氧化性的強弱。不同抗氧化劑清除羥自由基能力如圖10所示。不同抗氧化劑清除羥自由基的能力均隨濃度的增加而增大，膠原蛋白肽濃度為10mg/m L時對自由基的清除率達70.48%，明顯高于VC和BHT。不同抗氧化劑在濃度相同條件下，清除能力的大小依次為：多肽>茶多酚>BHT>VC。由此可知，鮟鱇魚皮膠原蛋白肽具有很強的清除羥自由基的能力。
3結(jié)論
鮟鱇魚皮中膠原蛋白是魚皮蛋白的主要組成成分。其最佳提取工藝為胃蛋白酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%，料液比為1：10( g/m L)，酶解時間6h，酶解溫度5℃。鮟鱇魚皮膠原蛋白肽的H y p提取率為11.46%。鮟鱇魚皮膠原蛋白肽的氨基酸組分中G l y，Pro，H y p等的與其性質(zhì)密切相關(guān)的氨基酸含量較高。鮟鱇皮膠原蛋白肽具有還原能力和清除．OH．．DPPH和O2-·作用，隨著濃度的增加清除率也相應(yīng)增大。其樣品濃度為10mg/m L時對．OH，．DPPH，O2-·的清除率和還原能力分別為70.48%，68.78%，42.53%和0.676%，相同濃度下，對．DPPH清除能力的大小依次為茶多酚>VC>多肽>BHT，對．OH清除能力的大小排列為多肽>茶多酚>BHT>VC。試驗分析了鮟鱇魚皮膠原蛋白肽對自由基的清除作用以及體外抗氧化作用，為探索實現(xiàn)鮟鱇皮的高值化加工利用途徑提供了可靠的依據(jù)。
