糙米發(fā)芽富集y-氨基丁酸工藝優(yōu)化的研究
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康文瀚1，田洪磊1，程衛(wèi)東1，詹萍1，王軍2，武強(qiáng)2
1．石河子大學(xué)食品學(xué)院（石河子832000）；2．石河子開發(fā)區(qū)合旭科技有限公司（石河子832000）
摘要利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化糙米發(fā)芽富集y-氨基丁酸的工藝參數(shù)，分析得出最佳條件下糙米發(fā)芽富集y-氨基丁酸的含量。糙米發(fā)芽是糙米富集y-氨基丁酸的一種形式，通過單因素試驗(yàn)確定出糙米發(fā)芽的發(fā)芽率，利用紙層析法測(cè)量，測(cè)量y-氨基丁酸的含量。最佳的富集條件是：浸泡溫度為30℃，浸泡時(shí)間為24 h，發(fā)芽溫度30℃，發(fā)芽時(shí)間為28 h。
關(guān)鍵詞發(fā)芽糙米；y-氨基丁酸；紙層析；響應(yīng)面分析
y-氨基丁酸（簡稱GABA）是一種天然存在的非蛋白質(zhì)氨基酸，是哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的抑制性神經(jīng)傳達(dá)物質(zhì)。約30%的中樞神經(jīng)突觸部位以GABA為遞質(zhì)。GABA在人體大腦皮質(zhì)、海馬、丘腦、基底神經(jīng)節(jié)和小腦中起重要作用，并對(duì)機(jī)體的多種功能具有調(diào)節(jié)作用。其作為一種存在于人類大腦中的氨基酸，是神經(jīng)的主要抑制性傳達(dá)物質(zhì)，亦存在于番茄、葡萄、蜜桔、土豆、茄子等水果蔬菜中。研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)芽的糙米內(nèi)亦含有較高的GABA，其作用能較好地緩解精神壓力，調(diào)節(jié)情緒，恢復(fù)身心健康，同時(shí)能縮短入睡時(shí)間和延長深睡眠時(shí)間，健腦，降血壓，鎮(zhèn)定神經(jīng)，改善脂肪代謝，防止動(dòng)脈硬化等。
GABA自2009年被國家批準(zhǔn)為新資源食品后，以其獨(dú)特的功能性和廣泛的適用范圍，成為國內(nèi)外飲料生產(chǎn)廠商在開發(fā)新產(chǎn)品、增加產(chǎn)品附加值、強(qiáng)化產(chǎn)品功能性等方面一個(gè)重要的研究課題和發(fā)展思路，擁有廣闊的市場(chǎng)前景。
通過了單因素試驗(yàn)先確定了以發(fā)芽率為參照標(biāo)準(zhǔn)的糙米發(fā)芽的最適條件，并采用紙層析法測(cè)量優(yōu)秀發(fā)芽率中GABA的含量，最后基于響應(yīng)面分析測(cè)定發(fā)芽糙米中GABA含量從而確定出富集GABA的最佳發(fā)芽條件。
1材料與方法
1.1試劑、儀器與設(shè)備
糙米：市售；GABA標(biāo)準(zhǔn)品：上海寶曼生物科技有限公司；無水乙醇、正丁醇、冰乙酸、硫酸銅等均為國產(chǎn)分析純。
HSQ-3恒溫水浴鍋：上海智域分析儀器制造公司；721分光光度計(jì)：上海第三儀器分析廠；MK-200高速粉碎機(jī)：南京威利朗食品機(jī)械有限公司：ZXSD-1 160全自動(dòng)新型生化培養(yǎng)箱：上海智城分析儀器制造有限公司；Neofuge15R高速冷凍離心機(jī)：利康發(fā)展有限公司；KQ-200VDE超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司。
1.2試驗(yàn)方法
1.2.1發(fā)芽糙米的制備
在糙米去除谷殼后，進(jìn)行人工精選去雜，以去除蟲蛀、霉變、異色粒和未成熟粒，無胚米及石頭等雜質(zhì)，去雜后先用自來水沖洗3遍，洗去表面的糠粉和灰塵，瀝干后，用0.12 mol/L的次氯酸鈉溶液消毒25min，再用純凈水沖洗3遍；取經(jīng)過前處理的糙米置于燒杯中，加入糙米10倍的水，并放人恒溫水浴鍋中浸泡，設(shè)置不同的溫度；浸泡一段時(shí)間后，取出糙米，用水清洗，并鋪于的培養(yǎng)皿中，蓋上保鮮膜，戳破幾個(gè)小孔透氣，將培養(yǎng)皿置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱（恒溫，相對(duì)濕度為95%）中，培養(yǎng)不同的時(shí)間；將按設(shè)定時(shí)間進(jìn)行浸泡和發(fā)芽后的糙米迅速取出，用純凈水沖洗3遍后，再用75℃～80℃的熱水進(jìn)行滅酶處理10 min。將水瀝干待用；將瀝干水后的發(fā)芽糙米平鋪到紙上，放入恒溫培養(yǎng)箱中( 30℃)中，干燥3h得到發(fā)芽糙米。其制備工藝流程為：
1.2.2發(fā)芽糙米中GABA的提取
將干燥后的發(fā)芽糙米，準(zhǔn)確稱取干重為10.0 kg的糙米樣品，研磨成均漿后定容至50 m L，于80℃水浴5 min待酶滅活后，溫度降至室溫后超聲提取2h，將提取液轉(zhuǎn)入離心管，置于離心機(jī)內(nèi)，以8 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min．取上清液為待測(cè)液。1.2.3糙米發(fā)芽條件對(duì)其發(fā)芽率及GABA含量的響應(yīng)面分析
采用Design-Expert 8.0.5軟件應(yīng)用響應(yīng)面分析法，根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，結(jié)合前期單因素試驗(yàn)，以GABA含量為響應(yīng)值，對(duì)單因素試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，采用紙層析法測(cè)定發(fā)芽糙米中 CABA含量，研究工藝條件對(duì)提取效果的影響，確定最佳工藝路線。
1.2.4指標(biāo)的測(cè)定
1.2.4.1 糙米發(fā)芽率的測(cè)定
將發(fā)芽后的糙米隨機(jī)分成3份，從每一等份中取出2.0～3.0 g糙米，統(tǒng)計(jì)其中已發(fā)芽糙米數(shù)（糙米胚牙露出種皮達(dá)0.5～1.0 mm長即為發(fā)芽糙米）。發(fā)芽率=發(fā)芽糙米數(shù)／總糙米數(shù)×100%。
1.2.4.2 GABA的測(cè)定
1.2.4.2.1 紙層析法GABA標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
將1mg/m L的GABA標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成濃度梯度0.1，0.2，0.3，0.4和0.5 mg/m L的溶液。將不同濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液在濾紙上點(diǎn)樣，展層，顯色，以GABA濃度X與吸光度Y繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
1.2.4.2.2 紙層析法GABA含量測(cè)定
1)點(diǎn)樣：吸取5μL待測(cè)液，點(diǎn)樣線距濾紙2.0cm，樣品間距2.0 cm。將5μL樣品分三次點(diǎn)，每點(diǎn)一次用電吹風(fēng)吹于。注意每點(diǎn)在紙上擴(kuò)散的直徑，最大不超過3 mm。
2)展層：將點(diǎn)好樣的濾紙（點(diǎn)樣面朝外）卷成簡狀，用透明膠帶將濾紙兩端粘住但兩端能不接觸。將濾紙直立于層析缸中（注意：點(diǎn)樣端在下，展層劑的液面需低于點(diǎn)樣線1 cm，濾紙勿與缸壁接觸），蓋好層析缸蓋，進(jìn)行展層。待溶劑上升15～20 cm時(shí)，取出濾紙，電吹風(fēng)吹干。展開劑：V（正丁醇）：V（醋酸）：V（水）=4：1：3，0.4 g/d L茚三酮。
3)顯色：濾紙?jiān)陔姶碉L(fēng)吹干后會(huì)顯色，將與標(biāo)準(zhǔn)品位置一致的斑點(diǎn)剪下，用洗脫液洗脫，紫外分光光度計(jì)在520 nm處進(jìn)行測(cè)定。洗脫劑：V（1 g/L硫酸銅）：V（體積分?jǐn)?shù)75%乙醇）=2：38。
1.2.5數(shù)據(jù)分析
試驗(yàn)采用Origin 8.5軟件制圖，SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素顯著性分析，Design-Expert 8.0.5軟件應(yīng)用響應(yīng)面分析。
2結(jié)果與分析
2.1 浸泡時(shí)間對(duì)糙米發(fā)芽率和對(duì)GABA含量的影響
如圖1所示，糙米的浸泡時(shí)間對(duì)糙米發(fā)芽率及其GABA提取量存在顯著差異(p<0.05)。當(dāng)糙米浸泡時(shí)間低于24 h時(shí)，隨著浸泡時(shí)間的增加，糙米的發(fā)芽率和GABA提取率也隨之增加，這可能是由于此階段屬于糙米吸水速度最快的物理吸漲過程，剛開始吸水時(shí)，隨著吸水率的升高發(fā)芽率也會(huì)隨之上升；而當(dāng)浸泡時(shí)間大于24 h時(shí)，隨著浸泡時(shí)間的增加，糙米
的發(fā)芽率和GABA的量卻有所下降，這主要是因?yàn)榻輹r(shí)間過久將會(huì)導(dǎo)致糙米吸水飽和，并使其細(xì)胞結(jié)構(gòu)嚴(yán)重受損，營養(yǎng)流失導(dǎo)致發(fā)芽率不高從而影響合成GABA。糙米的浸泡時(shí)間對(duì)GABA提取量的影響與在此條件下糙米發(fā)芽率趨勢(shì)較為一致，即GABA提取量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在浸泡24 h時(shí)，GABA提取率達(dá)到最大，為997.5 mg/kg，表明浸泡時(shí)間過長不利于發(fā)芽糙米生成GABA。因此，糙米最佳浸泡時(shí)間為24 h。
2.2浸泡溫度對(duì)糙米發(fā)芽率和GABA的影響
如圖2所示，當(dāng)浸泡溫度小于30℃時(shí)，隨著浸泡溫度的增加，糙米發(fā)芽率和GABA量也隨之增加，因?yàn)闇囟仍礁�，糙米的吸水率也越高，發(fā)芽情況越好；谷氨酸脫羧酶的活性也隨溫度升高而升高，產(chǎn)生的GABA也隨之增加；當(dāng)浸泡溫度大于30℃時(shí)，隨著溫度的增加，糙米的發(fā)芽率明顯下降，可能是因?yàn)椴诿孜柡秃�，隨著其胚芽的萌發(fā)，營養(yǎng)物質(zhì)損失造成。也可能是由于溫度過高，吸漲過快，吸水飽和后，細(xì)胞結(jié)構(gòu)受到損害，營養(yǎng)物質(zhì)傳遞不暢通所致。而GABA含量降低是因?yàn)殡S著溫度的升高，糙米中谷氨酸脫羧酶的活性受到了抑制，產(chǎn)生的GABA也隨之減少。糙米的浸泡溫度對(duì)GABA提取量的影響與在此條件下糙米發(fā)芽率趨勢(shì)較為一致，即GABA提取量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在浸泡溫度達(dá)到30℃時(shí)，
GABA提取率達(dá)到最大，為755.3 mg/kg，表明浸泡溫度過高不利于發(fā)芽糙米生成GABA。因此，糙米最佳浸泡溫度為30℃。
2.3發(fā)芽時(shí)間對(duì)糙米發(fā)芽率和GABA的影響
如圖3所示，當(dāng)發(fā)芽時(shí)間小于28 h時(shí)，隨著發(fā)芽時(shí)間的增加，發(fā)芽率明顯上升，這是因?yàn)椴诿壮鲅繒r(shí)間主要集中在這段時(shí)間內(nèi)；當(dāng)發(fā)芽時(shí)間大于28 h時(shí)，糙米發(fā)芽率隨著時(shí)間的增加幾乎不變，GABA也緩慢下降是因?yàn)殡S著發(fā)芽時(shí)間的增加，是因?yàn)樵诎l(fā)芽后期階段，GABA會(huì)在轉(zhuǎn)氨酶的作用下降解為琥珀酸半醛和丙酮酸，從而使GABA含量下降。而且隨著發(fā)芽時(shí)間的延長，糙米芽過長，顏色偏黃，微生物大量繁殖，容易腐爛，產(chǎn)生嚴(yán)重的發(fā)酵味。糙米的發(fā)芽時(shí)間對(duì)GABA提取量的影響與在此條件下糙米發(fā)芽率趨勢(shì)較不太相同，即發(fā)芽率隨著發(fā)芽時(shí)間先上升后穩(wěn)定而GABA提取量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在發(fā)芽28 h時(shí)，GABA提取率達(dá)到最大，為897.6 mg/kg，表明發(fā)芽時(shí)間過長不利于發(fā)芽糙米生成GABA。因此，糙米最佳發(fā)芽時(shí)間為28 h。
2.4發(fā)芽溫度對(duì)糙米發(fā)芽率和GABA的影響
如圖4所示，當(dāng)發(fā)芽溫度小于30℃時(shí)，隨著發(fā)芽溫度的增加，發(fā)芽率和GABA含量明顯增加，但溫度低時(shí)，發(fā)芽緩慢，發(fā)芽周期加長；糙米中大量的內(nèi)源酶被激活和釋放，GABA等其他營養(yǎng)物質(zhì)得以大量生成，但可以看出GABA量卻不高；當(dāng)發(fā)芽溫度大于30℃時(shí)，隨著發(fā)芽溫度的增加，GABA含量隨之小幅度降低，是因?yàn)闇囟冗^高抑制了谷氨酸脫羧酶的活
性，導(dǎo)致生成的GABA含量減少。糙米的浸泡溫度對(duì)GABA提取量的影響與在此條件下糙米發(fā)芽率趨勢(shì)較為一致，即GABA提取量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在發(fā)芽溫度為30 0C時(shí)，GABA提取率達(dá)到最大，為998.5 mg/kg，表明浸泡時(shí)間過長不利于發(fā)芽糙米生成GABA。因此，糙米最佳發(fā)芽溫度為30 ℃。
2.5響應(yīng)面分析法優(yōu)化提取試驗(yàn)結(jié)果與分析
2.5.1 回歸模型的建立及方差分析
通過單因素試驗(yàn)，得到了每個(gè)單因素的相對(duì)合適的條件，在此基礎(chǔ)上對(duì)影響發(fā)芽糙米富集GABA的因素（浸泡溫度、浸泡時(shí)間、發(fā)芽溫度和發(fā)芽時(shí)間）進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)。
對(duì)表1試驗(yàn)結(jié)果通過Design-Expert軟件程序進(jìn)行二次回歸響應(yīng)面分析。建立多立二次響應(yīng)面回歸模型，得二次多元回歸模型為：Y=901.22-
對(duì)該模型進(jìn)行方差分析( ANOVA)結(jié)果見表2。
由表可知回歸決定系數(shù)R2=0.996 1，修正決定系數(shù)為0.992 3，說明該模型能解釋0.992 3應(yīng)值的變化，失擬項(xiàng)不顯著(p>0.05)，因而該模型擬合程度良好，試驗(yàn)誤差小，可以用此模型對(duì)糙米富集GABA試驗(yàn)進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。通過宣接比較方程中一次項(xiàng)系數(shù)絕對(duì)值大小來判斷因素影響的主次性，對(duì)糙米富集GABA的影響因素由大到小依次是：B（浸泡時(shí)間）>C（發(fā)芽溫度）>D（發(fā)芽時(shí)間）>A（浸泡溫度）。
2.5.2響應(yīng)面分析法分析各因素間的相互作用結(jié)果
利用響應(yīng)面分析浸泡溫度、浸泡時(shí)間、發(fā)芽溫度和發(fā)芽時(shí)間各因素之間的相互作用結(jié)果如圖5所示。
浸泡時(shí)間和浸泡溫度對(duì)糙米富集GABA都顯出二次影響（圖5a），隨著二者的增加，GABA含量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，說明兩者的交互作用對(duì)糙米富集GABA含量影響顯著；從圖中還可以看出浸泡時(shí)間的曲面坡度比浸泡溫度的曲面坡度陡，說明浸泡時(shí)間對(duì)GABA含量的影響比浸泡溫度對(duì)GABA含量的影響要大。浸泡溫度與發(fā)芽溫度對(duì)糙米富集GABA的影響較大，可以明顯看出二者對(duì)GABA含量的影響具有二次效應(yīng)（圖5b），隨著兩者的增加，GABA的含量均呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)二者共同對(duì)CABA造成影響。
浸泡溫度與發(fā)芽溫度時(shí)間對(duì)GABA具有二次影響，隨著二者的增加，GABA含量都先增加后減�。▓D5c），二者的交互作用對(duì)糙米富集GABA含量影響顯著；且二者的曲面坡度十分明顯，浸泡時(shí)間比發(fā)芽溫度對(duì)GABA含量的影響更大。浸泡溫度與發(fā)芽時(shí)間對(duì)GABA含量都有二次效應(yīng)，隨著二者的增加，GABA含量先增加后減小且曲面坡度近似（圖5d）。隨著浸泡時(shí)間與發(fā)芽時(shí)間的增加，GABA的含量都先增加，達(dá)到最高值后減少（圖5e），說明二者對(duì)GABA含量都具有二次效應(yīng)；從二者曲面坡度可以看出，浸泡時(shí)間對(duì)糙米富集GABA的影響大于發(fā)芽時(shí)間的影響。隨著發(fā)芽溫度與發(fā)芽時(shí)間的增加，明顯看到GABA含量隨之增加后再減小。從它們曲面坡度可以看出，發(fā)芽時(shí)間比發(fā)芽溫度的坡度陡（圖5f），說明發(fā)芽時(shí)間對(duì)糙米富集GABA的影響更大。
2.6最優(yōu)條件的確定及驗(yàn)證
利用Design-Expert軟件對(duì)模型進(jìn)行進(jìn)一步分析，以獲得最優(yōu)的提取條件。經(jīng)分析得最佳的富集條件是：浸泡溫度為29.72℃，浸泡時(shí)間為24.84 h，發(fā)芽溫度29.67℃，發(fā)芽時(shí)間為27.94 h�？紤]到操作的方便性，將提取工藝參數(shù)修正為浸泡溫度為30℃，浸泡時(shí)間為24 h，發(fā)芽溫度為30℃，發(fā)芽時(shí)間為28h。在此條件下糙米富集GABA含量可達(dá)到906.563mg/kg。重復(fù)三次試驗(yàn)，與理論值相差1%，響應(yīng)面分析的的優(yōu)化結(jié)果與實(shí)際值較吻合，具有一定的可行性。
3結(jié)論
試驗(yàn)結(jié)果表明：浸泡溫度在30℃，浸泡時(shí)間24h，發(fā)芽溫度30℃，發(fā)芽時(shí)間28 h時(shí)，糙米發(fā)芽率達(dá)到最優(yōu)；浸泡溫度29.72 ℃，浸泡時(shí)間24.84 h，發(fā)芽溫度29.67℃，發(fā)芽時(shí)間27.94 h，發(fā)芽糙米富集GABA可達(dá)最佳。
考慮到實(shí)際操作可行性，將最佳條件修訂為：浸泡溫度為30℃，浸泡時(shí)間24 h，發(fā)芽溫度30 h，發(fā)芽時(shí)間28 h。通過驗(yàn)證試驗(yàn)，表明實(shí)際測(cè)量值接近預(yù)測(cè)值，說明該模型是合理有效的具有一定的實(shí)際指導(dǎo)意義。
