簕菜提取物及其化學(xué)成分對a-葡萄糖苷酶的抑制作用
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李晨悅1，李冬利2*，孫玉坤3，張桐葦1，董字琴1，張煜1， 2*
1．廣東工業(yè)大學(xué)輕工化工學(xué)院（廣州510006）；2．五邑大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院(江門529020)； 3．中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院(北京100083)
摘要試驗采用以對硝基苯-a-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)為底物的酶抑制劑篩選模型測定了簕菜提取物及其化學(xué)成分對a-葡萄糖苷酶的抑制作用，為簕菜降血糖作用提供試驗證據(jù)。試驗結(jié)果表明，不同部位的簕菜中的抑制a-葡萄糖苷酶的活性物質(zhì)都可以通過有機溶劑萃取步驟進(jìn)行濃縮；簕菜葉、莖和根的乙酸乙酯層都表現(xiàn)出最高的抑制活性：簕菜乙酸乙酯層的9個萜類和6個多酚類化學(xué)成分中，二萜化合物ent-kaur-15-en-17-al-19-oic aad和多酚化合物異綠原酸C具有最好的抑制a-葡萄糖苷酶的活性，均高于對照品阿卡波糖，它們可能是簕菜提取物具有抑制a-葡萄糖苷酶活性的作用成分。
關(guān)鍵詞簕菜；提取物；化學(xué)成分；a-葡萄糖苷酶；抑制劑
筋菜，學(xué)名為白筋(Acanthopanax trifoliatus( Linn) Merr．)，又稱鵝掌簕、三葉五加、三加皮、苦刺、刺三加，為五加科( Araliaceae)五加屬（Acanthopanax）植物。廣泛分布于我國中部和南部，印度、菲律賓、緬甸、泰國、越南和孟加拉國等地也有分布。簕菜是藥食兩用植物，筋菜產(chǎn)地民間自古就有采集簕菜作為鮮食蔬菜和保健藥材的習(xí)俗。筋菜在廣東江門市的恩平等地盛產(chǎn)，并且十多年前已經(jīng)開始了人工種植。據(jù)當(dāng)?shù)鼐用袼�，長期食用簕菜可以降血糖。但到目前為止，仍鮮見有關(guān)于簕菜降血糖作用方面的研究報道。因此，仍缺乏簕菜
降血糖作用的科學(xué)依據(jù)。試驗采用以對硝基苯-a-D-吡喃葡萄糖苷( PNPG)為底物的酶抑制劑篩選模型測定了筋菜提取物及其化學(xué)成分對a-葡萄糖苷酶的抑制作用，以期為簕菜降血糖作用提供一定的試驗證據(jù)。
1 材料與方法
1.1材料、試劑與儀器
筋菜：2012年4月份采于廣東省江門市恩平雪壯筋菜廠，經(jīng)中國科學(xué)院華南植物園葉華谷研究員鑒定為五加科植物簕菜。
a-葡萄糖苷酶、牛血清白蛋白( BSA)、對硝基苯-a-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)：美國Sigma-Aldrich公司；拜唐蘋（每片含50 mg阿卡波糖）：拜耳醫(yī)藥保健有限公司；其它試劑：國產(chǎn)分析純。
Infinite F200多功能酶標(biāo)儀：奧地利TECAN公司；單道、多道移液器：德國Eppendorf公司；96孔酶標(biāo)板：德國Greiner公司。
1.2方法
1.2.1簕菜提取物的制備
采集筋菜新鮮葉、莖和根，常溫干燥后粉碎，分別取出200 g，加入體積分?jǐn)?shù)為95%食用酒精進(jìn)行冷浸提取，每隔ld進(jìn)行過濾，共提取3次，合并提取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮得不同部位的醇提物（葉：L；莖：S；根：R）。各醇提物依次使用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇進(jìn)行萃取，濃縮干燥后分別得到石油醚層（葉：LP；莖：SP；根：RP）、乙酸乙酯層（葉：LE；莖：SE；根：RE）、正丁醇層（葉：I LN;莖：SN;根：RN）。所有提取物真空干燥后均4
1 0C保存?zhèn)溆谩?
1.2.2簕菜化學(xué)成分的獲得
筋菜乙酸乙酯層提取物經(jīng)反復(fù)硅膠柱層析、Sephadex LH-20柱層析、反相硅膠柱層析、制備薄層層析( pTLC)、MCI樹脂柱層析等分離手段，分離純化得到單體化合物，綜合運用現(xiàn)代波譜技術(shù)(IR、UV、MS、1H-NMR、13C_NMR、DEPT、1H-H COSY、HSQC、HMBC)以及與文獻(xiàn)比對確定了9個已知的萜類化合物的結(jié)構(gòu)（見圖1），它們的化學(xué)
試驗數(shù)據(jù)將另文發(fā)表。
通過UPLC-DAD-Q TOF MS及與標(biāo)準(zhǔn)品對照分析簕菜提取物中的多酚類化學(xué)成分，發(fā)現(xiàn)其中主要含有綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C和蘆丁，還含有少量的新綠原酸和隱綠原酸。試驗中所用的這些酚類化合物均購自成都普瑞法科技開發(fā)有限公司，純度為HPLC≥98%。
1.2.3 a-葡萄糖苷酶活性測試
a-葡萄糖苷酶溶液的配制：將酶凍干粉用0.1%BSA溶液溶解，配成100 U/m L的酶液，置于-20℃的冰箱中凍存。試驗前，將100 U/m L酶液用移液槍吸取少量，先用0.1% BSA溶液稀釋到20 U/m L，再用0.1%BSA溶液稀釋到0.2 U/m L備用。
PNPG溶液配制：稱取一定量的PNPG固體，用0.1 mol/L pH 6.8的磷酸鹽緩沖液(PBS)溶解，配成濃度為10 m mol/L，然后用1.5 m L的離心管分裝備用。
試驗采用比色法測定a-葡萄糖苷酶的活性。用二甲基亞砜( DMSO)溶解待測簕菜提取物或化合物，配制質(zhì)量濃度為10 mg/m L的備用溶液。再用PBS稀釋備用溶液，配置成所需濃度的待測溶液。在96孔板每孔中加入筋菜提取物或者化合物溶液（試驗組）、阿卡波糖溶液（陽性對照組）或PBS（陰性對照組）10μL，PBS 50μL，酶溶液20 μL，搖勻，置于37℃水浴恒溫10 min，然后加入PNPG溶液20μL，搖勻，37℃反應(yīng)10 min，再加入Na2CO3終止液30 111終止反應(yīng)，立即于405 nm處測定吸光度。樣品對a-葡萄糖苷酶的抑制率按下式計算：抑制率=（陰性對照組吸光度一試驗組吸光度）／陰性對照組吸光度×100%。當(dāng)樣品對a-葡萄糖苷酶的抑制率為50%時，將樣品質(zhì)量濃度定為半數(shù)抑制濃度( IC50)。
2結(jié)果與分析
2.1 筋菜提取物對a-葡萄糖苷酶的抑制活性
經(jīng)過初步篩選可知（圖2），在筋菜的提取物中，當(dāng)樣品作用濃度為1mg/m L時，筋菜葉、莖、根的提取物的抑制率分別為28.5%(L)，25.3%(S)和44.1%(R)，通過有機溶劑萃取分層后的提取物中，筋菜葉、莖、根的乙酸乙酯層都表現(xiàn)出最高的抑制率( LE: 97.3%; SE: 66.5%; RE: 77.3%)，并且都高于陽性對照阿卡波糖(59.1%)，說明不同部位的簕箭菜中的降糖活性物質(zhì)都可以通過有機溶劑萃取步驟進(jìn)行濃縮。
2.2筋菜化學(xué)成分對a-葡萄糖苷酶的抑制活性
從筋菜乙酸乙酯層中分離獲得了9個已知的萜類化合物，另外鑒定了筋菜提取物中還含有綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C、蘆丁和少量的新綠原酸和隱綠原酸。試驗測定了這些化合物抑制a-葡萄糖苷酶的活性。結(jié)果見圖3，當(dāng)作用濃度為0.1 mg/m L時，簕菜中含有的二萜化合物6和多酚化合物異綠原酸C具有最好的抑制a-葡萄糖苷酶的活性，抑制率分別為36.5%和3 1.2%，均高于對照品阿卡波糖的抑制率20.7%。
進(jìn)一步測定化合物6和異綠原酸C在不同濃度下對a-葡萄糖苷酶的抑制率（見表2），利用SigmaPlot軟件繪制藥物濃度一抑制率曲線（圖4），算出化合物6和異綠原酸C的IC50分別為146.5μg/m L和198.2μg/m L，均顯著低于阿卡波糖的IC50（512.5μg/m L）。說明這2個化合物對a-葡萄糖苷酶的抑制活性優(yōu)于阿卡波糖，它們可能是筋菜提取物具有抑制a-葡萄糖苷酶活性的作用成分。
3討論與結(jié)論
雖然目前為止未見有關(guān)于筋菜降血糖作用方面的研究報道，但有研究報道了同屬植物刺五加的根和莖皮具有降低糖尿病大鼠或小鼠胰島素抵抗的作用，也有研究報道了刺五加莖皮和葉都具有抑制a-葡萄糖苷酶的活性，從中得到的活性化合物主要是多酚類和黃酮類化合物。另有文獻(xiàn)報道很多植物來源的多酚類或黃酮類化合物都有抑制a-葡萄糖苷酶的活性，Gao等報道款冬花蕾的二咖啡酰奎寧酸類化合物能選擇性地抑制大鼠小腸來源的麥芽糖酶活性。試驗研究也表明筋菜中的二咖啡酰奎寧酸類化合物具有較好的抑制a-葡萄糖苷酶的活性，并且二咖啡�？鼘幩犷惢衔铮ó惥G原酸C、異綠原酸A）的活性強于單咖啡�？鼘幩犷惢衔铮ňG原酸、新綠原酸、隱綠原酸），這一發(fā)現(xiàn)與文獻(xiàn)報道結(jié)論相符。此外，文獻(xiàn)報道貝殼杉烷類二萜化合物16-kauren-19-oic acid具有抑制a-葡萄糖苷酶的活性，試驗研究也發(fā)現(xiàn)簕菜中的二萜類化合物ent-kaur-15-en-17-al-19-oic acid(6)具有很強的抑制a-葡萄糖苷酶的活性。因此，簕菜提取物的抑制a-葡萄糖苷酶的活性可能是2種活性成分共同作用的結(jié)果。簕菜作為一種藥食兩用植物，其降血糖作用具有進(jìn)一步研究和開發(fā)的價值。
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