低氧條件下好氧型微生物降解煤吸附甲烷實(shí)驗(yàn)
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田坤云，崔學(xué)鋒，張瑞林
（1．河南工程學(xué)院安全工程學(xué)院，河南鄭州451191；
2．河南理工大學(xué)安全科學(xué)與工程學(xué)院，河南焦作454003）
摘要：為了研究好氧型微生物對(duì)低氧氣濃度環(huán)境條件下煤吸附甲烷的降解效能，培養(yǎng)、分離、初步鑒定了高效降解甲烷的好氧型甲烷氧化菌。并在高壓容量法瓦斯吸附一解吸裝置的基礎(chǔ)上，自主開(kāi)發(fā)了低氧環(huán)境下甲烷降解實(shí)驗(yàn)分析系統(tǒng)，研究了氧氣濃度為0010、5%和15%三種條件下甲烷氧化菌的降解效能，通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)前后甲烷減少量，二氧化碳增加量，氧氣減少量進(jìn)行分析。結(jié)果表明：在氧氣濃度(0%~15%)范圍內(nèi)，隨著氧氣濃度升高及降解時(shí)間的持續(xù)，甲烷的減少量可達(dá)130.5 cm3，二氧化碳的增加量最高可達(dá)25.7 cm3，同時(shí)最多消耗69.0 cm3氧氣；在無(wú)氧條件下，好氧型甲烷氧化菌的生理活性受到了一定的限制，但最高仍然可以降解11.9 cm3的甲烷，生成二氧化碳3.5 cm3。
關(guān)鍵詞：甲烷氧化菌；好氧型；低氧環(huán)境；降解效能
0 引言
煤層瓦斯（主要成分是甲烷）是煤礦開(kāi)采過(guò)程中的主要致災(zāi)氣體，它不僅作為一種窒息性氣體嚴(yán)重污染井下作業(yè)環(huán)境，而且還是導(dǎo)致瓦斯異常涌出和煤與瓦斯突出的主要?jiǎng)恿υ�。隨著通過(guò)加強(qiáng)通風(fēng)、加強(qiáng)瓦斯抽放及綜合通風(fēng)與瓦斯抽放的瓦斯綜合治理技術(shù)向深部開(kāi)采的挺進(jìn)，地應(yīng)力升高，煤層透氣性降低等因素的制約已使之處于理論和技術(shù)的瓶頸，迫切需要尋找預(yù)防及治理煤層瓦斯災(zāi)害的新技術(shù)、新方法。1939年，A．3．尤洛夫斯基提出利用甲烷氧化菌氧化煤礦瓦斯以降低煤礦瓦斯?jié)舛鹊臉?gòu)想后，國(guó)外便開(kāi)始了對(duì)甲烷氧化菌應(yīng)用于煤礦降低瓦斯的探索。20世紀(jì)70年代，俄羅斯生命科學(xué)院和采礦研究院的專家把配置好的甲烷氧化菌液直接注入到煤層中，在鼓風(fēng)供氧的條件下使該處的瓦斯?jié)舛冉档土?00/0~60%。陳東科等在煤樣中加入M3011和GYJ3的甲烷氧化混合菌，通過(guò)電鏡分析，兩種甲烷氧化菌附著在煤樣孔隙表面，均生長(zhǎng)良好，試驗(yàn)中煤樣瓦斯平均降解率為44 010，最高達(dá)52%。重慶大學(xué)博士生毛飛通過(guò)在煤礦井下進(jìn)行微生物瓦斯處理實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)甲烷氧化菌能夠較大程度地降低實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)的瓦斯動(dòng)力現(xiàn)象，回風(fēng)流中瓦斯?jié)舛确謩e降低了22. 54%和77. 23%噸煤瓦斯含量分別降低了39. 67%和13. 45%河南工程學(xué)院張瑞林等在實(shí)驗(yàn)室條件下以構(gòu)造煤為研究對(duì)象，實(shí)驗(yàn)證明甲烷氧化菌AEM1235菌懸液在壓力(1 ~5 MPa)高瓦斯壓條件下仍具有較好的降解能力。
以上一系列研究成果均表明，烷氧化菌在煤礦瓦斯治理方面具有廣闊的應(yīng)用前景。然而，由于煤層瓦斯含量不僅極低，而且還處于動(dòng)態(tài)變化之中，本文自行設(shè)計(jì)了好氧型微生物降解甲烷實(shí)驗(yàn)分析系統(tǒng)，考查在常壓、低氧氣濃度條件下好氧型甲烷氧化菌對(duì)煤吸附甲烷的降解效能，以期為煤礦瓦斯治理及瓦斯災(zāi)害預(yù)測(cè)防治提供一點(diǎn)參考。
1 甲烷氧化菌分布分類及氧化機(jī)理
1.1 甲烷氧化菌的分布分類
甲烷氧化細(xì)菌( methane oxidizing bacteria)是一類可以甲烷為唯一碳源和能源生長(zhǎng)的微生物，在自然環(huán)境中有著廣泛的分布，在森林土壤、自然濕地、下水道淤泥、垃圾填埋場(chǎng)、油井附近土壤、沼澤地、火山噴發(fā)口處，強(qiáng)酸性、強(qiáng)堿性及極地凍土帶等極端環(huán)境中都發(fā)現(xiàn)它們的存在。除少部分生活在極端生境的甲烷氧化菌外，大多數(shù)甲烷氧化菌為喜中性，表土層5~ 10cm深處土壤類型和透氣性符合其生長(zhǎng)條件，甲烷氧化菌數(shù)量最多。
以細(xì)胞生理學(xué)為基礎(chǔ)，甲烷氧化細(xì)菌可以分為甲烷同化細(xì)菌( methane - assimilating bacteria MAB)和甲烷共氧化細(xì)菌( autotrophic ammonla - oxidizing bacteriaAAOB)，一般所說(shuō)的甲烷氧化細(xì)菌指的是甲烷同化細(xì)菌，這種細(xì)菌可以利用甲烷來(lái)獲取自身所需要的能量。好氧型甲烷氧化菌根據(jù)需氧量的多少可以細(xì)分為①專性好氧型甲烷氧化菌；②微需氧好氧型甲烷氧化菌；③兼性厭氧型甲烷氧化菌。專性好氧型甲烷氧化菌在代謝過(guò)程中需要足量氧氣，沒(méi)有氧氣或氧氣不足將終止代謝過(guò)程；微需氧好氧型甲烷氧化菌在代謝過(guò)程中也需要氧氣，但需氧量較少，沒(méi)有氧氣將終止代謝過(guò)程，而氧氣充足條件下代謝活動(dòng)也會(huì)受到抑制；兼性厭氧型在氧氣充足的條件下生長(zhǎng)良好，但是在沒(méi)有氧氣條件下也能生長(zhǎng)，但生長(zhǎng)情況弱于有氧氣條件下。具體的分類情況見(jiàn)表1。
根據(jù)形態(tài)、膜結(jié)構(gòu)、G+C mol%、16S rRNA測(cè)序、代謝途徑等系列特征可以把甲烷氧化菌分為typel型、ty-pell型和type X型，I型甲烷氧化菌主要含C16脂肪酸，胞內(nèi)膜成束狀分布，主要利用5-磷酸核糖途徑來(lái)同化甲醛。II型甲烷氧化菌屬于變形菌綱a亞綱，胞內(nèi)膜分布于細(xì)胞壁內(nèi)側(cè)，通過(guò)絲氨酸途徑氧化甲醛，X型的甲烷氧化菌同樣利用Rump途徑氧化甲醛，但是甲烷氧化菌含有較低水平的絲氨酸途徑所需要的二磷酸核酮糖磷酸酶。II型和X型甲烷氧化菌能固氮而大多數(shù)I型甲烷氧化菌不能。
1.2 甲烷氧化菌氧化甲烷機(jī)理
在化學(xué)上實(shí)現(xiàn)甲烷到甲醇的直接轉(zhuǎn)化是非常困難的，然而甲烷氧化菌在自身含有甲烷單加氧酶( Methanemonooxygenase．MMO)的作用下將甲烷氧化成甲醇，甲醇進(jìn)而在甲醇脫氫酶的作用下被氧化為甲醛。生成的甲醛一部分通過(guò)絲氨酸途徑( SERINE PATHWAY)或通過(guò)戊糖二磷酸途徑( RuMP PATHWAY)合成細(xì)胞物質(zhì)。另一部分甲醛則在甲醛脫氫酶作用下轉(zhuǎn)化為甲酸，甲酸進(jìn)而被氧化分解成CO，和H：0，CO：則重新回到大氣碳庫(kù)中。甲烷氧化菌的氧化機(jī)理如圖1所示。
2 實(shí)驗(yàn)過(guò)程
2.1 菌種的培養(yǎng)
本次實(shí)驗(yàn)中所使用的菌種是以信陽(yáng)市天梯水稻田土壤作為富集源，經(jīng)過(guò)反復(fù)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)，培養(yǎng)過(guò)程中優(yōu)化所使用的NMS培養(yǎng)基，調(diào)整培養(yǎng)基內(nèi)CuSO4．5H20至0. 03 mg/L，調(diào)整pH至6.5，優(yōu)化生長(zhǎng)溫度為30℃，恒溫?fù)u床轉(zhuǎn)速為120 r/min，經(jīng)格蘭仕染色，吲哚實(shí)驗(yàn)，高倍電子顯微鏡觀察等篩選出的高效降解甲烷的好氧型甲烷氧化菌株，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。
2.2 實(shí)驗(yàn)煤樣
從河南洛陽(yáng)新安煤礦二，煤層打孔鉆芯取樣，包裹嚴(yán)實(shí)帶回實(shí)驗(yàn)室，經(jīng)由球磨機(jī)磨碎，最終用篩網(wǎng)篩取粒度為0. 20~0.25 mm煤樣，放置于真空干燥箱中(80℃，-0.1 MPa)保存?zhèn)溆谩?/p>
2.3 實(shí)驗(yàn)用氣體及儀器
甲烷高壓氣體鋼瓶[純度99. 99 010，(13.0±0.5)MPa]，氧氣高壓鋼瓶[純度99. 99%，(13.0±0.5)MPa]，AUM -2滾筒式球磨機(jī)，氣體混合裝置，D08 -1GM型氣體質(zhì)量流量計(jì)，XSE電子分析天平，F(xiàn)ZG系列真空干燥箱，F(xiàn)S -5瓦斯解吸儀，HAC -1高壓容量法瓦斯吸附一解吸裝置，GDH - 0506超高精度恒溫槽，羅茲ZJ - 30真空泵，安捷倫7890a氣相色譜儀。
已有的好氧型甲烷氧化菌降解煤吸附瓦斯實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)往往只能在單一有氧或無(wú)氧的條件下進(jìn)行，然而煤系地層是在反復(fù)沉降變質(zhì)作用后形成的，氧氣含量不僅很低，而且區(qū)域分布上具有明顯的不均衡性，因此依據(jù)甲烷吸附一解吸實(shí)驗(yàn)裝置設(shè)計(jì)出一種低氧濃度環(huán)境下甲烷降解實(shí)驗(yàn)分析系統(tǒng)如圖2所示，進(jìn)氣管路上氣體質(zhì)量流量計(jì)不僅可以顯示瞬時(shí)流量還可以顯示累計(jì)流量，通過(guò)調(diào)節(jié)氣體質(zhì)量流量計(jì)就可以精確控制甲烷和氧氣不同混合比例，充氣完畢關(guān)閉減壓閥，打開(kāi)氣體混合裝置中間的開(kāi)關(guān)靜置30 min就可以使兩種氣體充分混合，為了校驗(yàn)氣體的真實(shí)濃度還在氣體混合裝置上方開(kāi)設(shè)有放氣口，可以收集混合氣體通過(guò)氣相色譜儀檢測(cè)分析氣體組分，實(shí)現(xiàn)了對(duì)氣體濃度的雙重控制。吸附罐增設(shè)有壓力表可以對(duì)吸附罐的充氣壓力進(jìn)行調(diào)節(jié)控制，本次實(shí)驗(yàn)研究的是在常壓下甲烷氧化菌的降解效能，因此若吸附罐中壓力增高則可以調(diào)節(jié)放氣閥，使罐內(nèi)的氣體恢復(fù)常壓。降解完成后由真空脫氣裝置抽取吸附罐內(nèi)氣體，經(jīng)由氣相色譜分析氣體組分。
2.4 實(shí)驗(yàn)過(guò)程
主要研究在低氧氣濃度下好氧型甲烷氧化菌的降解效能，因此共進(jìn)行三個(gè)水平實(shí)驗(yàn)，每一個(gè)水平設(shè)置三組對(duì)比實(shí)驗(yàn)，最后，每一水平實(shí)驗(yàn)求取平均值作為最終結(jié)果。實(shí)驗(yàn)中分別控制氧氣濃度為0%，5%和15%．而吸附罐充氣壓力則控制在常壓條件下，實(shí)驗(yàn)中每個(gè)吸附罐中均加入10 ml菌液。
實(shí)驗(yàn)過(guò)程包括：氣密性檢查，裝樣，噴灑菌液，脫氣，充氣及脫氣分析等過(guò)程。氧濃度為15%條件下降解煤吸附甲烷的步驟：
①對(duì)整個(gè)管路系統(tǒng)抽真空，以排除殘留空氣。打開(kāi)甲烷、氧氣鋼瓶開(kāi)關(guān)及減壓閥，通過(guò)氣體減壓閥調(diào)節(jié)氣體質(zhì)量流量計(jì)讀數(shù)使甲烷和氧氣的比例控制在17:3。
②關(guān)閉高壓氣體鋼瓶減壓閥，打開(kāi)混合裝置中間的針型閥，靜置混合10 min，在放氣口采集混合氣體并用氣象色譜儀分析其組分。
③將吸附罐裝入粒度為0.2~0. 25 mm真空干燥煤樣45 g，分層噴灑菌液10 ml，并使其混合均勻。擰緊吸附罐上的螺絲，真空脫氣10 min（以避免長(zhǎng)時(shí)間脫氣對(duì)甲烷氧化菌的活性造成影響），打開(kāi)氣體混合罐出口閥門(mén)及吸附罐閥門(mén)使煤樣吸附甲烷30 min，關(guān)閉吸附罐針型閥，放置在30℃恒溫水浴中進(jìn)行降解實(shí)驗(yàn)。
④12 h后開(kāi)啟真空脫氣裝置抽取吸附罐中氣體使其涌入瓦斯解吸儀，讀出放氣體積，并由氣相色譜儀分析氣體組分。
3實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析
對(duì)每一水平中各組煤樣進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并進(jìn)行氣體成分分析計(jì)算，取得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如表3所示，計(jì)算出二氧化碳的增加量并繪制圖形，如圖3所示。
從圖3中可以看出隨著氧氣濃度的升高，二氧化碳的增加量也迅速增多，12 h后這種增加量逐漸趨于停止，說(shuō)明甲烷氧化菌的生命活動(dòng)趨于停滯，可能隨著降解時(shí)間的進(jìn)行，甲烷氧化菌失去了理想的生存環(huán)境而失去降解能力，然而從另一方面間接證明了降解實(shí)驗(yàn)時(shí)間選擇在12 h是合理的。在無(wú)氧環(huán)境中二氧化碳也有一定程度的增加。二氧化碳的增加量是甲烷氧化菌新陳代謝活動(dòng)的象征，然而實(shí)驗(yàn)過(guò)程中僅僅分析二氧化碳的增加量是尚不夠的。許多研究已經(jīng)證實(shí)，二氧化碳的吸附能力要明顯大于甲烷，生成的二氧化碳可以對(duì)吸附甲烷進(jìn)行有效的置換，因此必須對(duì)降解過(guò)程中甲烷的減少量做出進(jìn)一步的研究。
從圖4中可以看出，隨著氧氣濃度的升高，甲烷的減少量在逐漸的增多，隨著降解時(shí)間的持續(xù)甲烷的減少量也在不斷的增加，然而這種增加量逐漸地減少，可以看出三條曲線最終趨于平緩。在氧氣濃度為0%的條件下，甲烷的減少量也并非為0，而是有一定程度的增加，可能是類似于兼性厭氧微生物的巴斯德效應(yīng)一樣，缺氧條件下細(xì)胞呼吸作用受到抑制，細(xì)胞為了獲得更多的能量則不斷消耗底物，然而這種無(wú)氧呼吸很快就停止了。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)在無(wú)氧條件下甲烷氧化菌吸收利用甲烷的能力相比有氧環(huán)境下明顯降低。
氧氣在甲烷氧化菌的降解過(guò)程中同樣處于核心地位，因此有必要了解其變化過(guò)程。
從圖5中可以看出，在氧氣濃度為5%和15 010條件下氧氣含量都有一定程度的減少。氧氣濃度越大，氧氣的減少量就越多，可能在氧氣濃度大的條件下，氧氣和所注入的好氧菌有了更大面積接觸；同時(shí)也激發(fā)了某些類型酶的活性，因此消耗了更多的氧氣。
4 結(jié)論
1)通過(guò)對(duì)富集的好氧型甲烷菌種進(jìn)行分離、純化、初步鑒定，得到了適合稀氧條件下仍然具有較好降解能力的微生物菌種。
2)為了研究常壓、低氧環(huán)境下好氧型甲烷氧化菌對(duì)煤吸附甲烷的降解性能，開(kāi)發(fā)了甲烷降解實(shí)驗(yàn)分析系統(tǒng)，滿足了實(shí)驗(yàn)需求。
3)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中通過(guò)改變氧氣濃度，最后得出一致結(jié)論：無(wú)氧環(huán)境中該型甲烷氧化菌的生理活性雖然受到了限制，然而仍可以進(jìn)行一段時(shí)間的降解活動(dòng)。在氧氣濃度(0%~15%)范圍內(nèi)隨著氧氣濃度的升高，甲烷和氧氣的減少量都得到增加，這一規(guī)律由降解最終產(chǎn)物二氧化碳?xì)怏w的增加量變化得到了比較充分的佐證。
