阿維鏈霉菌QL0827接合轉(zhuǎn)移體系的建立
相關(guān)鏈接： 中國(guó)安全網(wǎng) 中國(guó)質(zhì)量網(wǎng) 中國(guó)論文網(wǎng) 中國(guó)資訊網(wǎng)
周華艷1，2，周長(zhǎng)林1，竇潔1，方宏清2
1．中國(guó)藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇南京210009;2．軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所，北京100071
[摘要] 目的：建立工業(yè)生產(chǎn)菌株阿維鏈霉菌QL0827的接合轉(zhuǎn)移體系：方法：優(yōu)化接合轉(zhuǎn)移條件，建立該菌株的接合轉(zhuǎn)移體系；應(yīng)用優(yōu)化后的接合轉(zhuǎn)移體系，將基因中斷質(zhì)粒導(dǎo)入該菌，定向敲除基因組上的序列；再將攜帶基因組上特定序列的整合型質(zhì)粒和復(fù)制型質(zhì)粒導(dǎo)入該菌體，建立該菌株的基因過(guò)表達(dá)體系。結(jié)果：相比標(biāo)準(zhǔn)的接合轉(zhuǎn)移方法，優(yōu)化后接合轉(zhuǎn)移效率提高了近150倍，達(dá)到2.45x10-6；并成功地將pks3基因簇的部分序列刪除。結(jié)論：建立了阿維鏈霉菌QL0827的接合轉(zhuǎn)移體系。
[關(guān)鍵詞] 阿維鏈霉菌；接合轉(zhuǎn)移；基因敲除
[中圖分類(lèi)號(hào)]Q933[文章編號(hào)] 1009-0002( 2016)02-0188-04
阿維菌素( ave。mectin)是由阿維鏈霉菌(Strepto-myces avemitilis)產(chǎn)生的一類(lèi)結(jié)構(gòu)相似的十六元大環(huán)內(nèi)酯齊墩果糖雙糖衍生物，共有8個(gè)組分，分別為Ala.Alb、A2a、A2b、Bla、Blb、B2a和B2b，其中Bla的活性最高。阿維菌素及其重要的衍生物如伊維菌素(ivermectin)和多拉菌素(doramectin)，被廣泛用于防治動(dòng)植物線(xiàn)蟲(chóng)類(lèi)和節(jié)肢動(dòng)物類(lèi)害蟲(chóng)，是主要的生物農(nóng)藥和獸藥品種之一，具有很好的市場(chǎng)前景。阿維鏈霉菌QL0827是本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)重金屬誘變篩選方法獲得的一株高產(chǎn)的阿維鏈霉菌突變株。應(yīng)用傳統(tǒng)的遺傳誘變方法，對(duì)阿維菌素發(fā)酵效價(jià)的提高具有盲目性，同時(shí)后期的篩選工作量大。利用基因工程的方法可以克服這一缺點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)對(duì)工程菌的定向改造。在對(duì)鏈霉菌進(jìn)行基因改造的過(guò)程中，首先面臨的問(wèn)題就是要建立該菌株的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)。目前阿維鏈霉菌的遺傳操作主要通過(guò)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法、電轉(zhuǎn)化法和接合轉(zhuǎn)移方法來(lái)完成。接合轉(zhuǎn)移可在一定程度上跨越宿主的限制性屏障，是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。本研究確立了阿維鏈霉菌QL0827的接合轉(zhuǎn)移體系，利用此方法將聚酮體合成酶基因pks3部分序列進(jìn)行了刪除，并將基因組上一段能夠刺激阿維菌素表達(dá)的序列進(jìn)行了過(guò)表達(dá)，為利用基因工程方法定向改造該工程菌奠定了基礎(chǔ)。
1 材料和方法
1.1材料
大腸桿菌DH10B（用于質(zhì)粒構(gòu)建）、大腸桿菌ET12567 (pU28002)（用于大腸桿菌-阿維鏈霉菌之間的接合轉(zhuǎn)移）、工業(yè)生產(chǎn)菌株阿維鏈霉菌QL0827、大腸桿菌質(zhì)粒pUC19、大腸桿菌-鏈霉菌穿梭質(zhì)粒pKC1139和pSET152均由本實(shí)驗(yàn)室保存。
卡那霉素、氯霉素、安普霉素和萘啶酮酸鈉購(gòu)自Sigma公司；氨芐西林鈉購(gòu)自華北制藥股份有限公司；限制性?xún)?nèi)切酶購(gòu)自Thermo公司；PCR酶購(gòu)自Ta-KaRa公司；引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成（表1）。
1.2基本操作
阿維鏈霉菌培養(yǎng)和遺傳操作；大腸桿菌-阿維鏈霉菌接合轉(zhuǎn)移的方法并稍加改動(dòng)；接合轉(zhuǎn)移效率的計(jì)算方法；阿維鏈霉菌的發(fā)酵培養(yǎng)；大腸桿菌的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化；大腸桿菌質(zhì)粒提取參照天根生物技術(shù)有限公司質(zhì)粒小量提取試劑盒的使用說(shuō)明。
1.3 pks3生物合成基因中斷／敲除質(zhì)粒pKN-SLARl的構(gòu)建
以QL0827的總DNA為模板，PCR擴(kuò)增長(zhǎng)度為2096 b p的左同源臂SLI和2011 b p的右同源臂SR1；以質(zhì)粒pKC1139為模板，擴(kuò)增安普霉素抗性基因A;用電轉(zhuǎn)的方法將質(zhì)粒pKC1139的安普霉素抗性基因aac（3）IV置換成新霉素抗性基因neoR，構(gòu)建質(zhì)粒p KN;將片段SL1、A、SR1和質(zhì)粒p KN酶切后回收片段和骨架，再用T4DNA連接酶連接，即構(gòu)建成pks3生物合成基因簇打靶質(zhì)粒pKN- SLARl。
1.4特異性序列S4過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pKC-S4和pSET-S4的構(gòu)建
阿維鏈霉菌基因組上的一段特異性序列S4（EMBL接受號(hào)：AF440828）能夠刺激阿維鏈霉菌中阿維菌素的表達(dá)。首先以QL0827的總DNA模板，PCR擴(kuò)增長(zhǎng)度為3.5 kb的片段S4，用EcoR I /Xba1分別雙酶切片段S4、質(zhì)粒pKC1139和質(zhì)粒pSET152，用T4DNA連接酶將S4與質(zhì)粒連接，構(gòu)建成該序列的過(guò)表達(dá)載體pKC-S4和pSET-S4。
1.5 高效液相色譜(HPLC)測(cè)定阿維菌素B la組分
取阿維鏈霉菌發(fā)酵液，向發(fā)酵液中加入2倍體積的甲醇，振蕩均勻后于超聲波清洗器中超聲20min，4℃靜置5h后再次離心，取上清液稀釋至合適濃度后用HPLC測(cè)定阿維菌素B la組分的含量（流動(dòng)相為甲醇：水=85:15，流速為1 m L/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為246 nm)。
2結(jié)果
2.1 阿維鏈霉菌QL0827對(duì)抗生素的敏感性
為了建立一套有效的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，首先研究了阿維鏈霉菌QL0827對(duì)各種抗生素的耐受性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，這一菌株在2xYT液體培養(yǎng)基中對(duì)硫鏈絲菌素、新霉素、安普霉素、潮霉素和氯霉素敏感；在MS培養(yǎng)基中對(duì)上述5種抗生素也顯示出相同的敏感性。參考其他阿維鏈霉菌菌株遺傳篩選標(biāo)記，本實(shí)驗(yàn)選定安普霉素作為篩選標(biāo)記。研究結(jié)果顯示，在MS抗性平板中，濃度依次為5、1、5、5和10μg/m L的安普霉素、新霉素、硫鏈絲菌素、潮霉素和氯霉素即可完全抑制阿維鏈霉菌QL0827的生長(zhǎng)（表2）。選用50μg/m L安普霉素作為結(jié)合子篩選的濃度。
2.2阿維鏈霉菌QL0827接合轉(zhuǎn)移系統(tǒng)的建立
2.2.1 MS培養(yǎng)基中Mg Cl2濃度的確定MS培養(yǎng)基中的MgCl2濃度可以影響接合轉(zhuǎn)移的效率。將孢子熱激10 min，受體菌和供體菌按照1:1的比例混合后，涂布在MgCl2濃度分別為0、10、20、30、40、50m mol/L的MS培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)15～16 h后覆蓋萘啶酮酸和安普霉素溶液。由圖1A可看出當(dāng)MgCl2的濃度為30 m mol/L時(shí)，接合轉(zhuǎn)移效率最高。選定30m mol/L最為MS培養(yǎng)基中Mg Cl2的最佳濃度。
2.2.2熱激時(shí)間的確定不同的熱激時(shí)間可以影響
接合轉(zhuǎn)移效率。分別于50。C熱激0、6、8、10、12、14min，受體菌和供體菌按照1：1的比例混合后，涂布在Mg Cl濃度為30 m mol/L的MS培養(yǎng)基上，280C培養(yǎng)15~16 h后覆蓋萘啶酮酸和安普霉素溶液。結(jié)果顯示（圖1B），在熱激10 min的條件下可以長(zhǎng)出較多的轉(zhuǎn)化子。選定10 min為最佳熱激時(shí)問(wèn)。
2.2.3供體菌和受體菌的比例 不同的供受體菌比例可以影響接合轉(zhuǎn)移效率。將孢子熱激10 min，供體菌與受體菌分別按照1：10、1：100、10:1、100:1、1：1的比例混合后，涂布在Mg Cl,濃度為30 m mol/L的MS培養(yǎng)基上，28C培養(yǎng)15—16 h后覆蓋萘啶酮酸和安普霉素溶液。依據(jù)圖IC的結(jié)果，選定1:1作為最佳的供受體比例。
2.3 pks3基因的刪除和序列S4的過(guò)表達(dá)
2.3.1 質(zhì)粒pKN-SLARl的轉(zhuǎn)化和雙交換突變株的篩選將在大腸桿菌DH10B中構(gòu)建的質(zhì)粒p KN-SLAR1轉(zhuǎn)化大腸桿菌ET12567(pU28002)，再通過(guò)大腸桿菌-鏈霉菌之間的接合轉(zhuǎn)移，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入阿維鏈霉菌QL0827;挑選具有安普霉素抗性的菌株，連續(xù)3次在280C培養(yǎng)條件下生孢傳代后，挑選只有安普霉素抗性無(wú)卡那霉素抗性的菌株于液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)后提取總DNA;分別以提取的總DNA為模板，以SL15/SR13為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。如圖2所示，2、5、6號(hào)能夠擴(kuò)增出5.5 kb左右的條帶，為pks3基因缺失突變株QL0827-S1;其余不能擴(kuò)增出5.5 kb的條帶，為陰性菌，陽(yáng)性率為30%。同時(shí)，將PCR產(chǎn)物回收后測(cè)序，結(jié)果正確。
2.3.2轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pKC-S4和pSET-S4到阿維鏈霉菌QL0827中 將在大腸桿菌DH10B中構(gòu)建的質(zhì)粒p KC- S4和p SET- S4轉(zhuǎn)化大腸桿菌ET12567(pU28002)，再通過(guò)大腸桿菌-鏈霉菌之間的接合轉(zhuǎn)移，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入阿維鏈霉菌QL0827;挑選具有安普霉素抗性的菌株多次在安普霉素抗性的MS培養(yǎng)基上生孢傳代，再次挑選具有安普霉素抗性的菌株保存。此時(shí)獲得的菌株為序列S4過(guò)表達(dá)菌株QL0827( pKC-S4)和QL0827(pSF,T-S4)。
2.3.3 QL0827. QL0827 (p KC- S4)、QL0827( p SET-S4)和QL0827- S1的發(fā)酵結(jié)果 將驗(yàn)證后的QL0827.QL0827 (pKC-S4)和QL0827 (p SET- S4)與QL0827- S1分別進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，并進(jìn)行HPLC檢測(cè)。圖3A結(jié)果顯示，QL0827.QL0827 (pKC-S4)、QL0827( pSET-S4)和QL0827-SI產(chǎn)生阿維菌素組分B la的效價(jià)分別為4645.35、4463.145、5370.83和1326.49 mg/L，與出發(fā)菌株QL0827相比，DNA片段多位點(diǎn)插入突變株QL0827( pSET-S4)的阿維菌素中組分B la的效價(jià)提高了15.61%;QL0827(pKC-S4)與QL0827相比稍有下降；QL0827-S1發(fā)酵液中B la組分的效價(jià)下降了71.44010。QL0827-S1發(fā)酵液的菌濃也比QL0827的菌濃低了26.70%（圖3B）。
3討論
接合轉(zhuǎn)移作為一種基因轉(zhuǎn)移手段已在多種鏈霉菌中得到應(yīng)用，它不僅可以避開(kāi)胞外核酸酶，使DNA免遭核酸酶的降解，在某種程度上克服宿主對(duì)外源DNA的限制性障礙，而且操作程序也相對(duì)簡(jiǎn)單，是目前鏈霉菌遺傳轉(zhuǎn)化中廣泛使用的一種基因轉(zhuǎn)移方法。鏈霉菌不同菌屬之間差異很大，即使相同種屬，不同變種之間的轉(zhuǎn)化方法也存在一定程度的差異。本實(shí)驗(yàn)中的阿維鏈霉菌屬于高產(chǎn)菌株，應(yīng)用電轉(zhuǎn)化法和原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法都不能將質(zhì)粒成功地轉(zhuǎn)入菌體，推測(cè)可能和菌種自身的限制修飾系統(tǒng)以及原生質(zhì)體的再生能力有關(guān)。另外，應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的鏈霉菌接合轉(zhuǎn)移方法轉(zhuǎn)化效率也極低( 1.67x10-7)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)優(yōu)化接合轉(zhuǎn)移過(guò)程中的關(guān)鍵因素，建立了一套相對(duì)高效的大腸桿菌-阿維鏈霉菌QL0827接合轉(zhuǎn)移體系。在接合轉(zhuǎn)移體系中，阿維鏈霉菌QL0827的最適供受體菌比例是1:1，而鏈霉菌7 69的最適供受體菌的比例為1:10，諾爾斯鏈霉菌Xinao-4最佳供受體菌的比例為1：100。阿維鏈霉菌QL0827孢子在500C熱激10 min時(shí)接合轉(zhuǎn)移效率最高，這與諾爾斯鏈霉菌Xinao-4 -致，而龜裂霉素產(chǎn)生菌龜裂鏈霉菌的孢子在400C下熱激10min接合轉(zhuǎn)移效率最高。當(dāng)用于MS培養(yǎng)基中MgCl2的濃度為30 m mol/L時(shí)，阿維鏈霉菌QL0827有最高的接合轉(zhuǎn)移效率，這與龜裂鏈霉菌一致，阿維鏈霉菌高產(chǎn)菌株ATCC31780和阿維鏈霉菌野生型ATCC31267通常使用的MgCl2的濃度為10 m mol/L
或者采用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法，諾爾斯鏈霉菌Xinao-4的最佳MgCl2為40 m mol/L。采用最優(yōu)的轉(zhuǎn)化條件時(shí)阿維鏈霉菌QL0827的接合轉(zhuǎn)移效率為2.45x10-6，運(yùn)用此條件也成功地將質(zhì)粒pSET152轉(zhuǎn)入QL0827。雖然低于諾爾斯鏈霉菌Xinao-4和龜裂鏈霉菌，但該接合轉(zhuǎn)移效率足夠進(jìn)行基因敲除等遺傳操作。我們運(yùn)用該接合轉(zhuǎn)移條件，成功地將構(gòu)建的供體質(zhì)粒轉(zhuǎn)入阿維鏈霉菌QL0827，并將pks3基因簇的部分序列進(jìn)行了敲除，過(guò)表達(dá)了一段能夠提高阿維菌素產(chǎn)量的DNA序列。本研究建立的阿維鏈霉菌QL0827基因敲除體系為后續(xù)探討該菌種的次級(jí)代謝產(chǎn)物合成和代謝調(diào)控奠定了重要基礎(chǔ)。
