1-磷酸鞘氨醇受體在心肌梗死后心室重塑過程中的變差異
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李軍，郭艷麗，薛劍，寧世鋒，于農(nóng)，呂雙紅，劉安恒，張孝忠
軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，北京100071
[摘要] 目的：探討1-磷酸鞘氨醇(SIP)不同受體亞型(SIP1、SIP2.SIP3)在大鼠心肌梗死后心室重塑過程中的變化差異。方法：通過結(jié)扎大鼠左冠狀動脈前降支，建立大鼠心肌梗死模型，在心肌梗死后1、4、8周，采用實時熒光定量PCR的方法，分別檢測心臟非梗死區(qū)、梗死區(qū)、正常對照心肌組織SIP1、SIP2.SIP3的mRNA相對表達(dá)。結(jié)果：心梗后心室重塑階段，SI Pl mRNA的表達(dá)水平在非梗死區(qū)與梗死區(qū)的下降程度不一致，1周組非梗死區(qū)與正常對照組比較無統(tǒng)計學(xué)差異，而在梗死區(qū)2組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，在梗死區(qū)降低趨勢更為明顯。SIP2 mRNA在術(shù)后各組的非梗死區(qū)與正常對照心肌之間的表達(dá)比較，變化無統(tǒng)計學(xué)意義，且各時間點之間無差異，而在梗死區(qū)其表達(dá)變化較為顯著(P<0.01)。SIP3 mRNA在心梗后1周表達(dá)顯著增強(qiáng)(P<0.01)，4周表達(dá)出現(xiàn)降低，這種表達(dá)抑制在梗死區(qū)更為明顯（P<0.01和P<0.05）。結(jié)論：心室重塑階段的SIP1、SIP2 .SIP3 mRNA表達(dá)在非梗死區(qū)與梗死區(qū)變化不同步且各有特點，這種差異表達(dá)可能在心肌梗死后心室重塑過程中有重要意義。
[關(guān)鍵詞] 1-磷酸鞘氨醇；心肌梗死；心室重塑；1P磷酸鞘氨醇受體
[中圖分類號]R542.2 [文章編號] 1009-0002( 2016)02-0178-05
1-磷酸鞘氨醇（sphingosine-1-phosphate，SIP）來源于鞘磷脂代謝，是一種重要的脂質(zhì)調(diào)控分子，其既可作為細(xì)胞內(nèi)第二信使發(fā)揮作用，又可通過與細(xì)胞表面的特定受體結(jié)合而發(fā)揮廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，研究證實，在細(xì)胞的增殖、存活、遷移、凋亡等方面，SIP起到了重要的調(diào)節(jié)作用。在心血管疾病方面，在缺氧和缺血／再灌注誘導(dǎo)損傷的情況下，對于體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞和心臟功能，SIP都是公認(rèn)的保護(hù)調(diào)節(jié)分子。尤其在抑制心肌細(xì)胞凋亡、心肌缺血／再灌注損傷的保護(hù)等方面作用顯著。這些生理功能主要通過與其不同受體的作用而產(chǎn)生。SIP的受體曾被命名為內(nèi)皮分化基因(EDG)，這類受體與SIP有很高的親和力。根據(jù)國際藥理學(xué)聯(lián)盟的命名規(guī)范，2002年SIP相關(guān)受體被命名為SIP1、SIP2、SIP3、SIP4、SIP5171，在心血管系統(tǒng)主要分布SIP1、SIP2和SIP3。SIP與這些受體結(jié)合，可誘導(dǎo)多種信號通路的激活或抑制，引發(fā)不同生物學(xué)效應(yīng)。研究表明，SIP通過SIP1促進(jìn)缺氧的心肌細(xì)胞存活，對心肌細(xì)胞起保護(hù)作用。而除了保護(hù)作用，一些關(guān)于SIP通過其受體促進(jìn)心臟纖維化的作用也有報道，甚至有學(xué)者提出SIP3在SIP產(chǎn)生的促纖維化過程中扮演關(guān)鍵角色。心室重塑是心肌梗死后心力衰竭發(fā)生發(fā)展的中心環(huán)節(jié)，心臟成纖維細(xì)胞的激活和間質(zhì)纖維化是重要的病理過程。心室重塑的本質(zhì)是一種功能性、代償性和適應(yīng)性的變化，但持續(xù)發(fā)展會引起心臟結(jié)構(gòu)和功能出現(xiàn)不可逆、致病性改變。但是，有關(guān)SIP不同受體在梗死后心室重塑中的變化仍不清楚。在此，我們探討心肌梗死后心室重塑階段SIP受體的變化差異，以期幫助我們進(jìn)一步理解SIP在心臟的作用，為改善心肌梗死患者預(yù)后提供新的研究思路。
1 材料和方法
1.1材料
成年SPF級SD大鼠(220—250 g)由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供[許可證號：SCXK-（軍）2012-0004]。隨機(jī)分為4組，即正常對照組、1周梗死組、4周梗死組和8周梗死組。
實時定量逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TOYOBO ReverTraAce qPCR RT Master Mix with gDNA Remover);
水合氯醛注射液（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；SYBRPremix ExTaq（TaKaRa公司）；引物（表1）由TaKaRa公司設(shè)計合成并驗證。
心電圖機(jī)（ECG-9130P，日本光電公司）；動物呼吸機(jī)（ALC-V8，上海奧爾科特生物科技有限公司）；高通量組織破碎儀（TL-48P，上海萬柏公司）；RNA專用工作臺（Heraguard ECO，美國賽默飛公司）；熒光定量PCR儀（Bio-Rad IQ5，美國伯樂公司）；酶標(biāo)儀（DG5033B，杭州匯爾公司）。
1.2動物模型制備與取材
心肌梗死后心室重塑動物模型采取開胸手術(shù)，結(jié)扎左冠狀動脈前降支(left anterior descending ar-tery，LAD)的方法。給予腹腔注射麻醉，氣管切開，連接小動物呼吸機(jī)輔助呼吸，無菌條件下開胸，于LAD起始處下2 mm處結(jié)扎，結(jié)扎確實后心肌前壁顏色變白，室壁運動減弱，蘸去胸腔內(nèi)出血，逐層縫合胸腔；術(shù)后5 min連接肢體6導(dǎo)聯(lián)心電圖，出現(xiàn)I、Ⅱ、μL導(dǎo)聯(lián)ST段顯著抬高進(jìn)一步提示冠脈結(jié)扎成功（圖1）。術(shù)后給予大鼠保溫，連續(xù)3d給予青霉素肌肉注射，15萬U/d。室內(nèi)飼養(yǎng)，正常提供飲食、飲水。手術(shù)、注射等操作方法。
術(shù)后1、4、8周，采取尾靜脈靜推10%氯化鉀注射液的方法處死各組大鼠，立即開胸，摘取心臟，剪除心底部血管，用0～4℃冷PBS灌洗心腔，濾干后稱重。梗死部位通常較為明顯，將梗死交界區(qū)附近2mm左右組織剪去，以控制梗死區(qū)及非梗死區(qū)之間樣品的混雜。分離出左室非梗死區(qū)和梗死區(qū)心肌組織，迅速在液氮中速凍，存于-80℃冰箱待檢測。
1.3 RNA提取和實時熒光定量PCR檢測
利用TRIzol法提取RNA，再采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cD NA。RT- PCR反應(yīng)體系20I.L1包括SYBR Premix Ex Taq 10μL，上、下游引物(10μL mol/L)各0.8 μL,cD NA lVL,dH:0 7.4 VL。擴(kuò)增參數(shù)：第一步驟95℃持續(xù)30 s變性；第二步驟以95℃10 s、60℃30 s、72℃ 30 s反復(fù)40個循環(huán)；第1步驟制作溶解曲線，70~90℃每5s讀數(shù)一次，記錄結(jié)果。各組mRNA表達(dá)水平通過相對定量方法與管家GAPDH基因標(biāo)準(zhǔn)化后得出。
1.4結(jié)果分析
同一受體3個時間點與正常對照組之間的數(shù)據(jù)符合方差分析條件，利用Graphpad Prism 6軟件對多組進(jìn)行方差分析，P<0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義，并利用該軟件做圖。
2結(jié)果
2.1 實驗大鼠的存活狀態(tài)
共使用大鼠35只，存活至實驗終點25只，其中正常對照組5只，1、4、8周組依次有6.6、8只。圖1為大鼠心肌梗死模型心電圖。
2.2 SIP受體mRNA表達(dá)水平的變化
心肌梗死后非梗死區(qū)與梗死區(qū)的SIPl mRNA表達(dá)水平與正常對照組比較有下降趨勢（圖2），但二者下降程度并不一致：非梗死區(qū)SIPl mRNA在4周才觀察到有統(tǒng)計學(xué)意義的降低(P<0.05)（圖2A）；而在梗死區(qū)1周即觀察到顯著變化(P<0.05)，此后的4周組較1周組降低趨勢更為顯著(P<0.01)，其后的8周組與4周組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖2B）。
心肌梗死后非梗死區(qū)與梗死區(qū)SIP2 mRNA在非梗死區(qū)與梗死區(qū)表達(dá)變化趨勢差別明顯（圖3）。非梗死區(qū)SIP2 mRNA在心梗后各時間點變化無統(tǒng)計學(xué)意義（圖3A）。而在梗死區(qū)SIP2 mRNA表達(dá)變化較為明顯：1周即出現(xiàn)顯著降低(P<0.01)，并持續(xù)至心梗后4周左右，第8周表達(dá)顯著回升(P<0.01)，但表達(dá)水平低于正常對照組(P<0.01)（圖3B）。
非梗死區(qū)、梗死區(qū)SIP3 mRNA表達(dá)在心梗后1周與正常對照組相比顯著上調(diào)(P<0.01)（圖4），在4周組可觀察到mRNA表達(dá)受到抑制，梗死區(qū)較為明顯，持續(xù)抑制至8周并低于正常對照組水平(P<0.01)（圖4B）；非梗死區(qū)這種抑制現(xiàn)象較為平緩，8周組與正常對照組之間差別無統(tǒng)計學(xué)意義（圖4A）。
3討論
對SIP及相關(guān)受體在心血管疾病方面的研究主要集中在心肌的急性損傷，而關(guān)于心室重塑階段的研究文獻(xiàn)較少，且研究結(jié)果不一致，特別是關(guān)于SIP受體功能的研究爭議較大。心肌梗死后心室重塑是一個慢性缺血、缺氧過程。我們采取目前國際公認(rèn)的心室重塑的手術(shù)造模方法，對心肌梗死后心室重塑階段心肌組織SIP受體mRNA表達(dá)的變化差異進(jìn)行了研究。
本研究觀察到心肌梗死后重塑階段，非梗死區(qū)SIPl mRNA的表達(dá)水平下降，這與Yeh的報道基本一致：小鼠心肌梗死后2周SIPl mRNA表達(dá)水平較假手術(shù)組顯著降低，并持續(xù)降低至12周，而且我們發(fā)現(xiàn)在梗死區(qū)SIP1的mRNA表達(dá)降低更為顯著。我們推測心室重塑過程中伴有SIPI信號減弱，在梗死早期如果增強(qiáng)SJP1信號，對于促進(jìn)心肌細(xì)胞存活，保護(hù)心功能有益。事實上，這一點已有文獻(xiàn)支持：心梗后2周給予SIP1選擇性激動劑SEW2871,會減少非梗死區(qū)心肌細(xì)胞的凋亡，也會增強(qiáng)心肌功。這提示，SIP1受體激動劑對心肌梗死后心力
衰竭具有潛在的治療作用。研究證實，SIP2在細(xì)胞遷移、維持內(nèi)皮細(xì)胞功能等方面扮演重要角色，但有關(guān)心肌梗死后SIP2的研究報道較少。有學(xué)者通過干預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)，給予SIP2受體拮抗劑JTE-013，可以消除心力衰竭相關(guān)的肌源反應(yīng)，但SIP2在重塑階段扮演何種角色仍須進(jìn)一步研究證實。在鼠類的心梗早期及缺血／再灌注研究中發(fā)現(xiàn)SIP2 mRNA表達(dá)沒有顯著變化。我們通過實驗發(fā)現(xiàn)，在重塑階段非梗死區(qū)的SIP2 mRNA表達(dá)水平也較為恒定，但在梗死區(qū)的表達(dá)情況則完全不同，各組間變化趨勢明顯，差異顯著。SIP2主要表達(dá)在血管內(nèi)皮細(xì)胞，我們推測這種表達(dá)的差異與非梗死區(qū)、梗死區(qū)之間病理變化導(dǎo)致組織成分的改變有關(guān)，具體機(jī)制需要進(jìn)一步探討。SIP3是近年來組織、器官纖維化研究的一個熱點，學(xué)者提出SIP3參與了鞘氨醇激酶一l過表達(dá)導(dǎo)致的心臟纖維化過程。心室重塑是心梗后心力衰竭的不可逆改變，伴隨著心肌成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，令人費解的是在我們的研究中，從心梗后4周開始，無論梗死區(qū)或非梗死區(qū)．SIP3 mRNA的表達(dá)卻呈降低趨勢，是否存在一種負(fù)反饋機(jī)制，抑制了SIP3 mRNA的表達(dá)，啟動了心臟的“自救”途徑，值得深入研究。
至今罕有關(guān)于SIP受體在心肌梗死后心室重塑中作用的文獻(xiàn)報道。目前還未見關(guān)于心梗后梗死區(qū)SIP1、SIP2、SIP3 mRNA變化趨勢的報道。大多數(shù)心室重塑的研究局限于非梗死區(qū)，這與傳統(tǒng)心室重塑概念有關(guān)。心室重塑的最初定義是遠(yuǎn)離梗死區(qū)域的心肌組織的變化以及由急性心梗轉(zhuǎn)為慢性心衰的進(jìn)展過程。近年關(guān)于心力衰竭機(jī)制的研究逐漸深入，干細(xì)胞、組織工程等新技術(shù)應(yīng)用于醫(yī)學(xué)研究甚至臨床治療，心室重塑這一傳統(tǒng)概念有待改變。2014年心臟病學(xué)家Heusch等闡述了一個更為“廣義”的心臟重塑概念，打破了“非梗死區(qū)的局限”。而且研究證實SIP可以通過誘導(dǎo)造血干細(xì)胞到瘢痕區(qū)域，刺激梗死組織再生，提高心臟功能。所以梗死區(qū)不是心室重塑研究的禁區(qū)，更不應(yīng)當(dāng)忽略其潛在研究價值。
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