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 王麗萍1*，李祥1，師春蘭1，彭西峰2

 1．陜西科技大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院（西安710021）；2．九江學(xué)院(九江332005)

摘要  以氧化淀粉為原料，采用液化工藝，研究a-淀粉酶加量、體系pH、酶解溫度、酶解時(shí)間等對(duì)水解液中葡萄糖醛酸含量的影響，在此基礎(chǔ)上采用正交法優(yōu)化氧化淀粉最佳液化條件，在其它條件不變的情況下，當(dāng)體系pH為6.5、a-淀粉酶加量為12 m L，酶解溫度為85℃，酶解60 min時(shí)，水解液中葡萄糖醛酸含量可達(dá)到9.89%，該研究為高含量葡萄糖醛酸的制備奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞  氧化淀粉；液化；a-淀粉酶；葡萄糖醛酸

  葡萄糖醛酸是葡萄糖的伯醇羥基被氧化成羧基形成的化合物，因分子中同時(shí)存在高反應(yīng)活性的醛基和羧基，可與人體內(nèi)源性及外源性有毒物質(zhì)中的羥基、巰基、羧基、氨基等作用，達(dá)到排毒養(yǎng)顏的目的，現(xiàn)已被廣泛地應(yīng)用于功能性飲料、食品、減肥藥、化妝品等的添加劑中。葡萄糖醛酸又可以內(nèi)酯化形成呋喃環(huán)3，6-內(nèi)酯，即葡萄糖醛酸內(nèi)酯，它是人體結(jié)締組織及膠原的主要成分，是治療慢性肝炎、肝硬化、關(guān)節(jié)炎及膠原疾病的良藥�，F(xiàn)階段對(duì)于葡萄糖醛酸制備方法研究最廣泛的是芬頓試劑氧化法，即淀粉分子中的6-OH在芬頓試劑的作用下被氧化為羧基，原淀粉被氧化成為氧化淀粉，氧化淀粉在淀粉酶、糖化酶的作用下水解為葡萄糖醛酸。

  試驗(yàn)以氧化淀粉為原料，以葡萄糖醛酸含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，重點(diǎn)研究氧化淀粉在a-淀粉酶（液化酶）的作用下葡萄糖醛酸的變化規(guī)律，研究發(fā)現(xiàn)在最佳液化條件下，水解液中葡萄糖醛酸含量可達(dá)9.89%，該研究為綠色環(huán)保的葡萄糖醛酸生產(chǎn)工藝奠定了基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1原料

 氧化淀粉：實(shí)驗(yàn)室自制；氫氧化鈉、鹽酸、3，5-二硝基水楊酸、丙三醇、葡萄糖、間羥基聯(lián)苯、葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品：均為分析純，購(gòu)于西安化學(xué)試劑公司。

1.1.2設(shè)備與儀器

 D60-2F型電動(dòng)攪拌機(jī)：杭州儀表電機(jī)廠；HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋：國(guó)華電器有限公司；PB-10型酸度計(jì)：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；7230 G型可見分光光度計(jì)：上�？萍純x器有限公司制造；ThermoFisher Scientific Nicolet 6700 FT-IR傅里葉變換紅外光譜儀（美國(guó)）。

1.2方法

1.2.1葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及水解液的測(cè)定

 1)稱取0.1 g葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品置于100 m L容量瓶中，加水定容，配得1.00 mg/m L的葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)液。

 2)取上述標(biāo)準(zhǔn)液0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6和0.7 m L分別置于10 m L的具塞試管中，在冰水浴中加入5 m L四硼酸鈉／硫酸溶液，搖勻，在沸水浴中加熱5min后冷卻，將試管置于冰水浴中，用微量移液器精確加入1.5 mg/m L的間羥基聯(lián)苯100μ L，蓋上塞子搖勻，以1 m L蒸餾水做空白，在520 nm處測(cè)定吸光度，以標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖醛酸質(zhì)量濃度C( mg/m L)為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

 31取水解液0.5 m L，稀釋500倍，吸取1 m L置于10 m L具-塞試管中，按上述方法處理，在520 nm處測(cè)定水解液的吸光度，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線得出水解液中葡萄糖醛酸的含量。

1.2.2紅外譜圖表征

 采用傅里葉變換紅外光譜儀，測(cè)定葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和正交優(yōu)化條件下得到的水解液。

1.2.3試驗(yàn)方法

 稱取制得的氧化淀粉75.0 g置于250 m L三口瓶中，加150 m L水調(diào)制成淀粉乳，調(diào)節(jié)體系pH，加入a-淀粉酶，在一定的溫度下水解一定的時(shí)間后，再經(jīng)糖化反應(yīng)得水解液，按1.2.1測(cè)定葡萄糖醛酸含量。研究體系pH、a-淀粉酶加量、酶解溫度和時(shí)間等對(duì)葡萄糖醛酸的影響，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)，確定氧化淀粉的最佳酶解條件。

  2結(jié)果與分析

  2.1葡萄糖醛酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

 按1.2.1進(jìn)行試驗(yàn)，繪制葡萄糖醛酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

 圖1是以檢測(cè)得到的葡萄糖醛酸濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制出的葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得到回歸方程：A=6.089 29×C+0.112 86。

 R2=0.999 66，線性關(guān)系良好。因此，樣品中葡萄糖醛酸含量(%)計(jì)算公式如下：

2.2水解液的紅外表征與分析

按1.2.2進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見圖2。

 圖2為葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品與水解液中葡萄糖醛酸的紅外譜圖，水解液、葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品在3 400cm-1，1700 cm-1處有一個(gè)明顯的吸收峰，3 400 cm-1為O-H的伸縮振動(dòng)峰，1700 cm-1為醛類中的C=O伸縮振動(dòng)峰，說(shuō)明水解液中含有葡萄糖醛酸。與標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖醛酸的紅外圖譜相比，水解液在1100 cm-1左右出現(xiàn)一個(gè)明顯的峰，這是因?yàn)樗�解液中同時(shí)含有葡萄糖。

2.3 a-淀粉酶加量對(duì)水解液中葡萄糖醛酸含量的影響

 取6份75.0 g制得的氧化淀粉置于250 m L三口瓶中，加150 m L水調(diào)制成淀粉乳，調(diào)節(jié)體系pH為6.5，分別加入4，6，8，10，12和14 m L a-淀粉酶，在850C下水解反應(yīng)60 min，其余按1.2.3進(jìn)行，研究a-淀粉酶加量與葡萄糖醛酸含量的關(guān)系，試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。

 由圖3可以看出：在其它條件不變的情況下，隨著a-淀粉酶加量的增加，水解液中葡萄糖醛酸的含量呈先急劇增加，后基本不變的趨勢(shì)，其原因是，在底物（氧化淀粉）足夠時(shí)，酶促反應(yīng)的速度與酶的濃度（加量）成正比，但當(dāng)酶（a-淀粉酶）的濃度達(dá)到一定值后，酶被底物所飽和，酶解反應(yīng)速度不再隨酶濃度的增加而增加。故氧化淀粉水解時(shí)a-淀粉酶加量宜為12 m L。

 a-淀粉酶是一種內(nèi)切淀粉酶，能從非還原性末端隨即地切斷a-1，4糖苷鍵，形成三糖（糖酸）、二糖（糖酸）和單糖（糖酸）的混合物。淀粉分子中6-OH的含量約為10%，a-淀粉酶加量為12 m L時(shí)，水解液中葡萄糖醛酸的含量為6.98%，其原因是淀粉分子中含有直鏈淀粉和支鏈淀粉，支鏈淀粉是葡萄糖單元通過(guò)a-1，6糖苷鍵結(jié)合起來(lái)的，且在淀粉氧化過(guò)程中，可能發(fā)生裂解等副反應(yīng)或反應(yīng)不完全，致使水解液中葡萄糖醛酸的含量下降。

2.4酶解溫度對(duì)水解液中葡萄糖醛酸含量的影響

 取6份75.0 g氧化淀粉置于250 m L三口瓶中，加150 m L水調(diào)制成淀粉乳，調(diào)節(jié)體系pH為6.5，加入12mL a-淀粉酶，分別在65℃，70℃，75℃，80℃，85℃和90℃下水解反應(yīng)60 min，其余按1.2.3進(jìn)行，研究酶解溫度與葡萄糖醛酸含量的關(guān)系，試驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。

  由圖4可知，氧化淀粉酶解時(shí)a-淀粉酶的最適作用溫度為85℃，此時(shí)水解液中葡萄糖醛酸的含量為4.99%。其原因是溫度對(duì)酶促反應(yīng)有雙重影響，一方面，當(dāng)酶解溫度低于最適溫度時(shí)，隨著溫度的增加，酶解速度增加，溫度每升高10℃，酶促反應(yīng)會(huì)增加1.5～2.5倍。另一方面，a-淀粉酶是一種蛋白質(zhì)，溫度過(guò)高，蛋白變性，催化效率下降，酶解反應(yīng)的速度迅速變慢。

2.5  a-淀粉酶酶解時(shí)間對(duì)水解液中葡萄糖醛酸含量的影響

  取6份75.0 g氧化淀粉置于250 m L三瓶中，加150 m L水調(diào)制成淀粉乳，調(diào)節(jié)體系pH為為6.5，加入12 m L a-淀粉酶，分別在85℃下分別水解20，30，40，50和60 min，其余按1.2.3進(jìn)行，研究酶解時(shí)間與葡萄糖醛酸含量的關(guān)系，試驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。

 由圖5可以看出，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，水解液中葡萄糖醛酸的含量呈先增加后基本不變的趨勢(shì)，其原因是隨著反應(yīng)的進(jìn)行，底物（氧化淀粉）濃度越來(lái)越小，產(chǎn)物（葡萄糖醛酸）濃度越來(lái)越大，產(chǎn)物對(duì)酶促反應(yīng)產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用，致使反應(yīng)速度降低，產(chǎn)物濃度基本不變。在其它條件不變的情況下，酶促反應(yīng)為60 min時(shí)，水解液中葡萄糖醛酸的濃度最大為

7.21%。

2.6 pH對(duì)水解液中葡萄糖醛酸含量的影響

 取6份75.0 g氧化淀粉置于250 m L三口瓶中，加150 m L水調(diào)制成淀粉乳，調(diào)節(jié)體系pH分別為5.0，5.5，6.0，6.5和7.0，加入12 m L a-淀粉酶，在85℃下分別水解60 min，其余按1.2.3進(jìn)行，研究體系pH與葡萄糖醛酸含量的關(guān)系，試驗(yàn)結(jié)果如圖6所示。

 由圖6可以看出，體系pH對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響為一倒鐘形曲線，倒鐘形曲線的頂點(diǎn)為該反應(yīng)的最適pH，大于或小于最適pH，反應(yīng)速度均下降，促反應(yīng)的最適pH介于6.0～6.5之間。

 高于或低于酶促反應(yīng)的最適pH，①可能使酶的空間結(jié)構(gòu)破壞，引起酶的活力喪失，這種喪失活力可以是可逆的或者是不可逆的，對(duì)可逆的來(lái)說(shuō)，改變pH后可使活力恢復(fù)；②影響酶的活性部位催化基團(tuán)的離解狀態(tài)，使得底物不能分解成產(chǎn)物；③影響酶的活性部位結(jié)合基團(tuán)的離解狀態(tài)，使得底物不能和它結(jié)合。

2.7正交試驗(yàn)結(jié)果

 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，考慮因素之間的相互影響，以a-淀粉酶加量、酶解溫度、pH和酶解時(shí)間為影響因素，按試驗(yàn)1.2.3進(jìn)行正交試驗(yàn)。

 由表1可以看出，對(duì)水解液中葡萄糖醛酸含量影響的因素依次為：酶加量、pH、酶解溫度和酶解時(shí)間，正交優(yōu)化出的水解條件與單因素試驗(yàn)結(jié)果一致。再稱取氧化淀粉75 g，按照優(yōu)化的最佳條件進(jìn)行反應(yīng)，在pH為6.5，溫度為85℃的體系中加人a-淀粉酶12 m L，酶解60 min時(shí)，水解液中葡萄糖醛酸的含量最高為9.89%。

3結(jié)論

 采用單因素和正交試驗(yàn)法確定了葡萄糖醛酸制備工藝中的最佳酶解條件，研究發(fā)現(xiàn)在體系pH為6.5，酶解溫度為85℃，加入12 m L a-淀粉酶后酶解60 min時(shí)，水解液中葡萄糖醛酸含量最高，可達(dá)到9.89%。