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楊懿1,2，萬(wàn)德友2，劉蘊(yùn)慧2，馮紅茹2，楊利2，高新2，宋海峰1,2

1．安徽醫(yī)科大學(xué)，安徽合肥230032；2．軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京100850

[摘要]  目的：在真核細(xì)胞中融合表達(dá)胰高血糖素樣肽1( GLP-1)，純化后探究產(chǎn)物的生物學(xué)活性。方法：通過(guò)預(yù)留酶切位點(diǎn)將合成的CLP-1-IgG2σ F c融合蛋白表達(dá)序列連入表達(dá)載體質(zhì)粒，用電轉(zhuǎn)方法將線性化質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CHO-K1細(xì)胞，通過(guò)亞克隆篩選出蛋白高表達(dá)細(xì)胞株；收集高表達(dá)細(xì)胞株培養(yǎng)上清并初步純化，采用口服葡萄糖耐量試驗(yàn)( OGTT)探究GLP-1融合蛋白降低血糖的生物學(xué)活性。結(jié)果：經(jīng)過(guò)一輪亞克隆，篩選得到的細(xì)胞株的GLP-1融

合蛋白產(chǎn)量達(dá)1g/L，OCJTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明CLJP-1融合蛋白具有降血糖生物活性。結(jié)論：GLP-1變體和IgG2σ的F c段連接是一種可行的融合蛋白形式，融合蛋白具有GLP-1受體激動(dòng)劑的降糖作用，并且細(xì)胞株的篩選方式和初步純化方法也具有可行性，為后續(xù)的體內(nèi)、外活性研究和純化方法確定提供了基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞]  胰高血糖素樣肽1；受體激動(dòng)劑；融合蛋白；真核表達(dá)；口服葡萄糖耐量試驗(yàn)

[中圖分類(lèi)號(hào)]  Q78; Q25[文章編號(hào)]  1009-0002( 2016)02-0173-05

 胰高血糖素樣肽1(glucagon like peptide-l，GLP-1)是由胰高血糖素原基因編碼的一種腸促胰島素激素，由腸道L細(xì)胞在接受進(jìn)食刺激后合成分泌�；�于其血糖依賴(lài)性的促進(jìn)胰島素分泌作用和抑制胰高血糖素釋放作用，GLP-1成為一種極具潛力的糖尿病治療藥物。然而，制約GLP-1成藥的主要因素是其小分子多肽固有的高腎清除率和體內(nèi)二肽基肽酶( dipeptidyl- peptidase，DPP)Ⅳ對(duì)于GLP-1特定位點(diǎn)的酶切。GLP-1的改造也集中在這2個(gè)方面。本研究中的GLP-1融合蛋白，是在GLP-1的基礎(chǔ)上融合了“沉默抗體”IgG2σF c段，我們?cè)噲D通過(guò)這樣一種連接大分子蛋白的手段來(lái)降低GLP-1的腎清除率和免疫原性。同時(shí)，參考以往對(duì)

GLP-1(7-36)的改造，我們選擇了A8G/G26E/R36G這樣一種改造方式來(lái)避免DPP-Ⅳ對(duì)GLP-1的酶解。為了深入了解GLP-1-IgG2σFc融合蛋白在降低血糖、延長(zhǎng)半衰期方面的可能性，我們構(gòu)建了GLP-1融合蛋白的表達(dá)載體，并穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CHO-K1細(xì)胞，用初步純化出的融合蛋白在C57BL小鼠中進(jìn)行了活性鑒定。

1  材料和方法

1.1材料

 中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞Kl（CHO-KI）由本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)并凍存，使用GIBCO公司的CD-CHO液體培養(yǎng)基；大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)于原平皓（天津）生物技術(shù)有限公司；真核表達(dá)載體SGLs由本實(shí)驗(yàn)室凍存于-800C冰箱；GLP-1融合蛋白表達(dá)序列由上海捷瑞生物- -程有限公司合成；HindⅢ和EcoR I限制性?xún)?nèi)切酶、T4DNA連接酶購(gòu)白TaKaRa公司；快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒.BCA定量試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)生物技術(shù)有限公司；高純度質(zhì)粒小量快速提

取試劑盒購(gòu)白博邁德生物技術(shù)有限公司；無(wú)內(nèi)毒素中提質(zhì)粒試劑盒購(gòu)自MACHEREY-NAGEL公司；測(cè)序與引物合成南上海生L生物技術(shù)有限公司完成；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗人IgG( H+L)抗體購(gòu)白中杉金橋公司；生物素標(biāo)記的GLP-1抗體購(gòu)自Thermo Fisher公司；L-蛋氨酸砜亞胺(L-methio-nine sulfoximine,MSX)和1xGS Supplement購(gòu)自Sig-ma公司；Hi-Trap protein A層析柱購(gòu)自GE Health-care；利拉魯肽(liraglutide)購(gòu)自諾和諾德公司。

1.2  GLP-1融合蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建

 在設(shè)計(jì)的GLP-1融合蛋白序列兩側(cè)分別加入HindⅢ和EcoR I酶切位點(diǎn)，交上海捷瑞生物工程有限公司合成。用HindⅢ和EcoR I將GLP-1融合蛋白序列從合成的重組質(zhì)粒pBluescriptⅡ上切下來(lái)，同時(shí)對(duì)SGLs U載體質(zhì)粒行HindⅢ和EcoR I雙酶切（酶切體系50 11L，包含HindⅢ1.5 VL，EcoR I1.5 μL，10x緩沖液2 5μL，10xBSA 5μL，質(zhì)粒共約2μg，用ddH2O補(bǔ)足），對(duì)酶切產(chǎn)物行1%瓊脂糖凝膠電泳，回收918( pBluescriptⅡ)和7528  b p( SGLs)核酸條帶，用T4DNA連接酶將2片段連接成載體SGLs- GLP-1 -IgG2cr（載體和片段摩爾比為1：10，160C連接過(guò)夜），轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，并將在LB培養(yǎng)基中活化的DH5a接種于LB固體培養(yǎng)基平板（含氨芐西林），于370C溫箱內(nèi)培養(yǎng)14 h后挑取菌落測(cè)序鑒定(引物為RW: 5'- GACTCGGGGCC GTTCATCA-3')。

1.3  GLP-1融合蛋白表達(dá)載體在CHO細(xì)胞中的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染及亞克隆

 用Pvu I對(duì)構(gòu)建的載體SGLs- GLP-1-IgG2cr進(jìn)行線性化處理（總體系100 VL，包含P vu I 5μL，10xK緩沖液10μL，10xBSA 10 μL，ddH_0 8poL，中提質(zhì)粒SGLs-GLP-l-IgG2cr 67 μL約10μg）；將線性化的質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入CHO細(xì)胞（電轉(zhuǎn)參數(shù)：電壓300 V，電容900 μF，電擊時(shí)間15.9 ms），電擊后的細(xì)胞轉(zhuǎn)至96孔板（每孔含培養(yǎng)基100 μL）繼續(xù)培養(yǎng)24 h，后每孔補(bǔ)加150 μL培養(yǎng)基，使每孔培養(yǎng)基含有50 μL MSX和1xGS Supplement;經(jīng)過(guò)20 d的培養(yǎng)，挑選長(zhǎng)勢(shì)好的單克隆孔轉(zhuǎn)移至含1mL培養(yǎng)基的24孔板中，7d后選取優(yōu)勢(shì)單克隆孔轉(zhuǎn)移至小搖瓶中培養(yǎng)（4 m L培養(yǎng)基加入1 m L細(xì)胞），5d后根據(jù)表達(dá)量和細(xì)胞狀態(tài)擇優(yōu)擴(kuò)大至大搖瓶中（26 m L培養(yǎng)基加入4 m L細(xì)胞），培養(yǎng)5d后細(xì)胞凍存留作后續(xù)細(xì)胞株篩選用；篩選時(shí)，用間接ELISA相對(duì)定量(1:10000，辣根酶標(biāo)記的山羊抗人Ig G抗體)和SDS-PAGE對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行檢測(cè)，綜合結(jié)果選取高表達(dá)細(xì)胞株進(jìn)行亞克隆；經(jīng)亞克隆篩選后，最終挑選2G11細(xì)胞株進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)；將2G11細(xì)胞株在大搖瓶中連續(xù)培養(yǎng)14 d，每天取培養(yǎng)液上清100μL做SDS-PAGE檢測(cè)和間接ELISA相對(duì)定量，確定連續(xù)培養(yǎng)時(shí)間。

1.4  GLP-1融合蛋白的初步純化

 2GI1細(xì)胞株連續(xù)培養(yǎng)12 d后收集上清，利用GLP-1融合蛋白含有的IgG  Fc段進(jìn)行初步Protein A親和層析（純化體系：pH7.4的10 m mol/L PBS平衡液，pH3.0的50 m mol/L檸檬酸緩沖液，pH9.0的Tris- HCl中和液），50 m mol/L檸檬酸緩沖液10 min梯度洗脫，并迅速用Tris -HCl中和液對(duì)洗脫的蛋白進(jìn)行中和，用超濾管對(duì)蛋白超濾濃縮并用10 m mol/L pH7.4的PBS對(duì)溶媒進(jìn)行替換，使用BCA定量試劑盒對(duì)超濾濃縮后的蛋白進(jìn)行定量。

1.5  GLP-1融合蛋白的鑒定

 對(duì)純化后的融合蛋白(200 n g)行SDS-PAGE，將2塊膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至2張硝酸纖維素膜上，用PBST（含5%的脫脂奶粉）封閉1 h，分別用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗人Ig G(H+L)(1.5000)抗體和生物素標(biāo)記的GLP-1抗體(1: 5000)孵育2h，用TBST對(duì)硝酸纖維膜清洗6次，生物素標(biāo)記的GLP-1抗體處理的膜再使用鏈霉親和素標(biāo)記的辣根過(guò)氧化物酶(1:100 000)孵育處理1 h，清洗6次后，加入底物發(fā)光液(TMB)進(jìn)行曝光顯影。

1.6  GLP-1融合蛋白在C57BL小鼠中的降血糖作用

 30只8周齡C57BL雄性小鼠，初始血糖差異不顯著，按照單因素完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)隨機(jī)分為5組：6 mg/kg GLP-l-IgG2σ試驗(yàn)組(相當(dāng)于100 n mol/kg)、1.5 mg/kg GLP-l-IgG2σ試驗(yàn)組(相當(dāng)于25 n mol/kg)、0.3 mg/kg GLP-I-IgG2σ試驗(yàn)組(相當(dāng)于5 n mol/kg)、0.1 mg/kg利拉魯肽(相當(dāng)于25 n mol/kg)陽(yáng)性藥組、陰性對(duì)照組（生理鹽水）�？诜�葡萄糖耐量試驗(yàn)(oral glucose tolerance test，OGTT)前小鼠適應(yīng)1周，試驗(yàn)前空腹14 h，并在葡萄糖(1.5 g/kg)灌胃前30 min腹腔給藥處理。灌胃后的0、10、20、30、60、90 min取小鼠尾尖血測(cè)血糖，并觀察期間小

鼠的狀態(tài)。

2結(jié)果

2.1  GLP-1融合蛋白重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

 對(duì)合成基因的重組質(zhì)粒pBlues criptⅡ和表達(dá)載體質(zhì)粒SGLs行HindⅢ和EcoR I雙酶切，核酸電泳圖顯示pBlues criptⅡ被剪切為918和2948 b p兩條片段，而SGLs載體被剪切為428和7528 b p兩條片段（圖1A）。用T4 DNA連接酶將918 b p的GLP-1融合蛋白表達(dá)片段和7528 b p的表達(dá)載體片段連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌D H5a后挑取在含氨芐西林的LB平板上生長(zhǎng)的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化菌落進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果顯示成功構(gòu)建了GLP-1融合蛋白表達(dá)載體（圖2）。用無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒提取表達(dá)質(zhì)粒并進(jìn)行線性化處理（圖1B），用于下一步的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，結(jié)果顯示線性化后質(zhì)粒大小約為8000 b p。

2.2  GLP-1融合蛋白穩(wěn)定細(xì)胞株的建立

 通過(guò)比對(duì)最初轉(zhuǎn)染96孔板上的細(xì)胞培養(yǎng)5d的上清和經(jīng)過(guò)一輪亞克隆后的細(xì)胞培養(yǎng)5d的上清的蛋白SDS-PAGE結(jié)果，顯示穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞株可以穩(wěn)定表達(dá)GLP-1融合蛋白(還原蛋白實(shí)際M r為36x103)，并且經(jīng)過(guò)一輪亞克隆后細(xì)胞株的蛋白表達(dá)量明顯上升（圖3）。最后對(duì)篩選出的高表達(dá)細(xì)胞株2GI1進(jìn)行為期14 d的連續(xù)培養(yǎng)，結(jié)果顯示（圖4）細(xì)胞株的蛋白表達(dá)量逐日增加，在第13 d時(shí)非目的蛋白條帶大量出現(xiàn)，故選擇連續(xù)培養(yǎng)至12 d時(shí)收取細(xì)胞培養(yǎng)上清。

2.3  GLP-1融合蛋白的初步純化

 GLP-1融合蛋白含有IgG2σ的F c段，因此我們采用Protein A親和層析的方法對(duì)細(xì)胞上清進(jìn)行蛋白純化，通過(guò)對(duì)蛋白梯度洗脫，發(fā)現(xiàn)在洗脫液比例達(dá)到40%時(shí)蛋白即被洗脫下來(lái)，故在后續(xù)的純化洗脫步驟均使用40% pH3.0的50 m mol/L檸檬酸緩沖液。洗脫的蛋白超濾濃縮后行SDS-PAGE，結(jié)果顯示目的蛋白還原處理后單鏈M約為36x103。為了弄清GLP-1融合蛋白完整結(jié)構(gòu)是否具有Ig G段和GLP-1段，用Western印跡檢測(cè)了經(jīng)非還原處理的完整二聚體融合蛋白，結(jié)果顯示完整的GLP-1融合蛋白可以同時(shí)被針對(duì)Ig G和GLP-1的抗體檢測(cè)到，M r約為60x103。見(jiàn)圖5。

2.4 C57BL/6J小鼠的OGTT

 對(duì)C57BL/6J小鼠進(jìn)行OGTT后，結(jié)果顯示高、中、低劑量的GLP-1融合蛋白同陽(yáng)性藥利拉魯肽一樣均顯示出顯著的降血糖作用（圖6A），各組GLP-1融合蛋白和陽(yáng)性藥利拉魯肽在120 min的OGTT過(guò)程中的血糖曲線下面積均顯著小于PBS組，但高劑量GLP-1融合蛋白的降糖作用并非顯著優(yōu)于中劑量，這也提示在進(jìn)一步試驗(yàn)中應(yīng)當(dāng)降低蛋白藥物的高、中劑量（圖6B）。綜上所述，初步認(rèn)為構(gòu)建表達(dá)的GLP-1融合蛋白具有降低血糖的生物活性。

3討論

 Ⅱ型糖尿病是一種以胰島素相對(duì)不足和胰島素抵抗為特征的慢性疾病，是糖尿病的主要類(lèi)型，Ⅱ型糖尿病人群占糖尿病患病人群的90%以上。目前糖尿病的主要治療藥物為雙胍類(lèi)藥物、噻唑烷二酮類(lèi)藥物、磺脲類(lèi)藥物、基礎(chǔ)胰島素、DPP-Ⅳ抑制劑和GLP-1受體激動(dòng)劑。傳統(tǒng)的糖尿病治療藥物有低血糖、增加體重等副作用，而GLP-1受體激動(dòng)劑具有血糖依賴(lài)性降血糖和控制體重的作用，因此該研究領(lǐng)域得到高度關(guān)注。但GLP-1的2種天然活性形式GLP-1 (7-37)和GLP-1( 6-37)為小分子多肽，易被腎排出，并且被體內(nèi)DPP-Ⅳ特異性酶解，故GLP-1受體激動(dòng)劑的研發(fā)全都集中在增大GLP-1分子及酶切位點(diǎn)的替換和遮蔽上。

 在本研究中，我們采用融合蛋白的方式將GLP-1變體與IgG2σ的Fc段通過(guò)連接肽連接，在極大地提高了GLP-1的相對(duì)分子質(zhì)量的同時(shí)，還進(jìn)行了同GLP-1受體激動(dòng)劑利拉魯肽（2014年美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市銷(xiāo)售）一樣的氨基酸位點(diǎn)替換( A8GIG26EIR36G)。其中應(yīng)用的IgG2σ為一種“完全沉默”抗體，研究顯示IgG2σ相對(duì)于以往常用于融合蛋白的IgG (IgG2m4、IgGI、IgG4 ProAlaAla)具有最小的免疫原性。我們期望這樣一種GLP-1融合蛋白可以在保持GLP-1生物活性的同時(shí)延長(zhǎng)半衰期。

 構(gòu)建好GLP-1融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒后，我們采用哺乳動(dòng)物細(xì)胞CHO穩(wěn)定轉(zhuǎn)染方式表達(dá)融合蛋白。一方面可以有效地對(duì)高表達(dá)細(xì)胞株進(jìn)行篩選從而獲得大量蛋白用于后續(xù)試驗(yàn)，另一方面在哺乳細(xì)胞中表達(dá)的蛋白相較于其他表達(dá)平臺(tái)可以最大程度地接近人源構(gòu)象。通過(guò)一輪亞克隆后的穩(wěn)定細(xì)胞株的融合蛋白表達(dá)量達(dá)到1g/L的水平，為后續(xù)試驗(yàn)提供了蛋白量的保證。目前本實(shí)驗(yàn)采用的純化方式為Protein A親和層析，理論上可以有效地提取出所有帶IgG2σF c段的融合蛋白。但是結(jié)合Western印跡和SDS-PAGE結(jié)果，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞表達(dá)的產(chǎn)物可能還存在多聚體的情況，故還須進(jìn)一步摸索純化方法，以獲得單一的GLP-1融合蛋白。

 GLP-1受體激動(dòng)劑降血糖作用具有血糖依賴(lài)性，根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)，我們?cè)O(shè)計(jì)在腹腔給予高、中、低劑量的GLP-1融合蛋白30 min后進(jìn)行口服葡萄糖耐量試驗(yàn)，結(jié)果顯示融合蛋白可以顯著降低餐后血糖。根據(jù)血糖變化情況和AUC得出以下結(jié)論：融合蛋白在1.5 mg/kg時(shí)即已達(dá)到最大有效劑量，可以初步看出血糖的控制情況具有劑量依賴(lài)性，并且與陽(yáng)性對(duì)照藥利拉魯肽，相比，小鼠體內(nèi)降糖作用具有非劣性。

 根據(jù)以上研究結(jié)果，我們認(rèn)為GLP-1融合蛋白具有GLP-1受體激動(dòng)劑的降糖作用，且細(xì)胞株的篩選方式和初步純化方法具有可行性，為后續(xù)的體內(nèi)、體外活性研究和純化方法確定提供了基礎(chǔ)，同時(shí)也可為相關(guān)的融合蛋白研究提供參考。