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張夢雄，楊志新，王榮，陸健異，夏炳輝，周曉巍，黃培堂

軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所，北京100071

[摘要]  目的：建立不通過克隆步驟高通量表達(dá)來源于人單個B細(xì)胞的抗體輕、重鏈基因的方法。方法和結(jié)果：PCR擴增3個末端重疊的DNA片段，即①CMV啟動子和編碼抗體引導(dǎo)區(qū)序列的片段；②抗體IgG1重鏈恒定區(qū)序列和牛生長激素(BGH)poly(A)信號序列，輕鏈I g K恒定區(qū)序列和BGH poly(A)信號序列，輕鏈I gλ恒定區(qū)序列和BGH poly(A)信號序列；以及③抗體基因可變區(qū)序列VHs V k或V、。3個片段通過重疊延伸PCR構(gòu)建全長線性片段即線性表達(dá)框，將此來源于人單個B細(xì)胞的配對的抗體輕、重鏈線性表達(dá)框共轉(zhuǎn)染293E細(xì)胞，72 h收集上清檢測到表達(dá)的抗體。結(jié)論：構(gòu)建的抗體基因線性表達(dá)框是無須克隆，快速高通量表達(dá)抗體基因進(jìn)行篩選．分析的策略。

[關(guān)鍵詞]單克隆抗體；單個B細(xì)胞；抗體基因；重疊延伸PCR;線性表達(dá)框

[中圖分類號]  Q78; R392.1 [文章編號]  1009-0002(2016)02-0158-05

 抗體由2條相同的重鏈和2條相同的輕鏈構(gòu)成，抗體輕、重鏈基因具有多樣性，主要由V、D、J基因的突變和重組所決定。功能性VH的基因片段約50個，編碼重鏈可變區(qū)的CDR1和CDR2;DH基因片段位于VH和JH基因簇之間，約25個，編碼大部分CDR3;JH基因位于DH下游，約有6個功能性片段，編碼部分CDR3和CDR4。輕鏈的功能性V k的基因片段約40個，J k約5個；而功能性Vλ的基因片段約40個，Jλ約4個。正是由于抗體具有多樣性的特點，才能使人的免疫系統(tǒng)識別各種各樣的抗原。近年來，單克隆抗體在病原體致病機理研究、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究及被動免疫治療方面都發(fā)揮著越來越重要的作用。當(dāng)人體受到病原體感染或接種疫苗后，就會產(chǎn)生大量針對特定抗原的淋巴細(xì)胞，通過擴增分離出的單個B淋巴細(xì)胞，就可以獲得大量輕、重鏈配對的抗體基因，這就是單個B細(xì)胞技術(shù)。與其他技術(shù)相比，通過單個B細(xì)胞技術(shù)可以獲得全人源天然配對的單克隆抗體，而且獲得抗體的效率很高。但是單個B細(xì)胞技術(shù)需要克隆表達(dá)大量序列未知的抗體基因，才能進(jìn)行進(jìn)一步的篩選和鑒定，這部分工作費時費力，大大降低了該技術(shù)的效率。因此，需要一種高效的瞬時表達(dá)抗體基因的方法，以便高通量篩選抗體。理論上講，表達(dá)重組的抗體基因只須具備轉(zhuǎn)錄翻譯相關(guān)的必要元件即可，這些元件包括CMV啟動子、抗體引導(dǎo)區(qū)序列、抗體輕、重鏈恒定區(qū)和poly( A)信號序列，以及通過PCR擴增出的抗體輕、重鏈的可變區(qū)基因等。通過一步PCR將抗體表達(dá)所需的各個元件構(gòu)建成一個完整的線性表達(dá)框，再將配對的輕、重鏈線性表達(dá)框共轉(zhuǎn)染到真核細(xì)胞中進(jìn)行瞬時表達(dá)，就可以獲得完整的功能性抗體分子。在本研究中，我們采取上述方法，表達(dá)了從腎綜合征出血熱康復(fù)期患者外周血B細(xì)胞中獲得的抗體基因。

1  材料和方法

1.1材料

 293E懸浮細(xì)胞，分別表達(dá)抗體重鏈、K輕鏈和入輕鏈的質(zhì)粒pTSEGln-S、pTSEK-S、pTSEL-S由劉志剛博士惠贈；DNA純化試劑盒購自天根生化科技有限公司；PCR熱啟動酶Transtar購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；去內(nèi)毒素小提中量試劑盒購自O(shè)me-ga公司；Freestyle 293無血清培養(yǎng)基購自Gibco公司；轉(zhuǎn)染試劑fectoPRO購自Polyplus公司；HRP標(biāo)記的羊抗人二抗購自Earth公司；引物和測序由上海生工生物工程有限公司完成。

1.2從單個B細(xì)胞中擴增抗體可變區(qū)基因

 通過RT-PCR和巢式PCR兩步擴增編碼抗體輕、重鏈可變區(qū)的基因，擴增反應(yīng)在96孔PCR板上進(jìn)行，每孔中有一個從人外周血中分離的單個B細(xì)胞。RT-PCR反應(yīng)在每孔中加入一步RT-PCR試劑和擴增重鏈可變區(qū)、K輕鏈可變區(qū)、入輕鏈可變區(qū)的上、下游引物的混合引物，在30μL反應(yīng)體系中進(jìn)行擴增。第二步巢式PCR以RT-PCR反應(yīng)的產(chǎn)物為模板，建立3個反應(yīng)體系，分別擴增重鏈可變區(qū)基因、K輕鏈可變區(qū)基因、λ輕鏈可變區(qū)基因，最后以巢式PCR產(chǎn)物為模板，以表1所列引物擴增用于構(gòu)建線性表達(dá)框的可變區(qū)基因片段。

1.3構(gòu)建線性表達(dá)框

 線性表達(dá)框包括3部分，一是啟動子及抗體引導(dǎo)區(qū)（P區(qū)），二是抗體可變區(qū)編碼區(qū)（V區(qū)），三是恒定區(qū)編碼區(qū)及poly(A)區(qū)（C區(qū)）；表達(dá)重鏈和輕鏈?zhǔn)褂孟嗤�的啟動子和引�?dǎo)區(qū)，重鏈、K輕鏈和入輕鏈分別有不同的恒定區(qū)。以表達(dá)抗體重鏈的表達(dá)質(zhì)粒pTSEGln-S為模板，以pTSE-pCMVf、pTSE -pCMVr為引物擴增CMV啟動子一抗體引導(dǎo)區(qū)片段（PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4 min，以94℃變性40 s、55℃退火40 s、72℃延伸1.5 min進(jìn)行25個循環(huán)，72℃再延伸10 min，4℃保溫30 min）；以pTSEGln-S、表達(dá)K輕鏈的質(zhì)粒pTSEK-S、表達(dá)入輕鏈的質(zhì)粒pTSEL-S為模板，分別以pTSE-hpolyAF、pTSE-kpolyAF、pTSE-LpolyAF為正向引物，以pTSE-polyAr為反向引物擴增相應(yīng)載體的恒定區(qū)-BGH poly(A)片段（PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4 min，以94℃變性40 s、55℃退火40 s、72℃延伸2 min進(jìn)行25個循環(huán)，72℃再延伸10 min，4℃保溫30 min）；表達(dá)漢城病毒抗體18D4（K輕鏈）時，分別以帶有該抗體輕、重鏈可變區(qū)編碼序列的質(zhì)粒為模板擴增可變區(qū)片段；未知抗體可變區(qū)片段來源于1.2。V片段 5’端與P片段3’端有24個重疊核苷酸，V片段3’3端與C片段5’5端有24個重疊

核苷酸。再以這3個片段為模板，P片段、可變區(qū)片段、C片段按摩爾比1:3:1混合，以pTSE-pCMVf和pTSE-polyAr為引物，通過重疊延伸PCR擴增完整的線性表達(dá)框（PCR反應(yīng)條件：加入引物之前，先以94℃4 min、50℃ 5 min、72℃10 min進(jìn)行1個循環(huán)，然后加入上下游引物，94℃預(yù)變性4 min，以94℃變性40 s、52℃退火40 s、72℃延伸4 min進(jìn)行25個

循環(huán)，72℃再延伸10 min，4℃保溫30 min）。

1.4線性表達(dá)框轉(zhuǎn)染293E細(xì)胞瞬時表達(dá)抗體

 將輕、重鏈配對的重鏈表達(dá)框和輕鏈表達(dá)框各250 n g共轉(zhuǎn)染293E細(xì)胞表達(dá)抗體，轉(zhuǎn)染時細(xì)胞密度為2x105/m L，轉(zhuǎn)染及細(xì)胞培養(yǎng)在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中進(jìn)行，每孔含560 VL細(xì)胞，150 r/min、5% CO2、370C培養(yǎng)48～72 h，1000 r/min離心5 min，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，經(jīng)10% SDS-PAGE和Western印跡（HRP標(biāo)記的羊抗人Ig G）檢測表達(dá)產(chǎn)物。同時，以轉(zhuǎn)染抗體表達(dá)質(zhì)粒作為對照。

1.5  18D4抗體的特異性檢測

 用包被液稀釋滅活的漢城病毒L99，至終濃度（蛋白濃度）為10μ g/m L，每孔100μL于4℃包板過夜。PBST漂洗3次，每孔加入300μL 2%的BSA，370C封閉2h，再用PBST漂洗3次，每孔加入100μL收獲的表達(dá)上清或稀釋液，370C孵育2h，PBST漂洗3次，每孔加入100 μL HRP標(biāo)記的羊抗人IgG抗體（1:5000稀釋），370C孵育1.5 h，PBST漂洗3次，加入底物OPD顯色10～15 min，加1 mol/L硫酸終止，在酶聯(lián)儀上讀取D4。2nm值。

1.6  通過ELISA對通量表達(dá)的抗體定量

 為了檢測抗體是否表達(dá)并對細(xì)胞培養(yǎng)上清中的抗體進(jìn)行定量，以羊抗人IgG抗體500 ng/孔包板，其他同18D4抗體的特異性檢測。

2結(jié)果

2.1  從單個B細(xì)胞中擴增抗體可變區(qū)基因

 從單個B細(xì)胞中擴增抗體基因，由于基因序列是未知的，因此第一步RT-PCR在每一個反應(yīng)體系中都需要加入多個引物的混合物，包括擴增不同亞型重鏈、K輕鏈、入輕鏈的引物，反應(yīng)產(chǎn)物直接用作第二步巢式PCR反應(yīng)的模板。在巢式PCR反應(yīng)中，重鏈、K輕鏈、入輕鏈?zhǔn)欠謩e擴增的，瓊脂糖凝膠電泳可以檢測到相應(yīng)大小的片段。第三步PCR反應(yīng)的目的是在片段的兩端引入與線性表達(dá)框中其他片段的重疊區(qū)域，這一步只擴增輕、重鏈配對的抗體可變區(qū)基因片段（圖1）。

2.2線性表達(dá)框構(gòu)建

 線性表達(dá)框的結(jié)構(gòu)如圖2A所示。以質(zhì)粒載體為模板[ pTSEGln-S、pTSEK-S、pTSEL-S含抗體輕、重鏈的CMV啟動子一引導(dǎo)區(qū)段及恒定區(qū)-poly( A)段]，分別擴增出抗體輕、重鏈的CMV啟動子一引導(dǎo)區(qū)段及恒定區(qū)-poly( A)段，輕、重鏈的CMV啟動子一引導(dǎo)區(qū)段約為1260 b p，輕、重鏈的恒定區(qū)-poly( A)段分別約為980和1650 b p（圖2B）。將從B細(xì)胞獲得的天然配對的輕、重鏈抗體可變區(qū)基因片段與膠回收后對應(yīng)的輕、重鏈CMV啟動子一引導(dǎo)區(qū)段及恒定區(qū)-poly(A)段通過重疊延伸PCR構(gòu)建成完整的線性表達(dá)框。構(gòu)建的線性表達(dá)框重鏈約3250 b p，輕鏈約2600 b p（圖2C）。通過此方法構(gòu)建了130對配對的輕、重鏈線性表達(dá)框。

2.3  不通過克隆表達(dá)抗體VH和VL基因

 通過重疊延伸PCR構(gòu)建的抗體輕、重鏈的線性表達(dá)框含有抗體表達(dá)所必需的表達(dá)元件，包擴CMV啟動子序列，抗體輕、重鏈引導(dǎo)區(qū)序列，可變區(qū)，恒定區(qū)及BGH poly(A)信號肽序列。為確定線性表達(dá)框是否可以表達(dá)出具有活性的抗體，我們將實驗室前期制備的一個針對漢城病毒具有特異性的抗體基因18D4構(gòu)建到線性表達(dá)框中，將含有該抗體輕、重鏈基因的質(zhì)粒和線性表達(dá)框在相同的條件下分別轉(zhuǎn)染293E細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，用羊抗人IgG抗體進(jìn)行Western印跡檢測，2種表達(dá)方式都檢測到抗體輕、重鏈2條帶，相對分子質(zhì)量分別為55X103和25x103（圖3A）。ELISA檢測表明分別用線性表達(dá)框和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293E細(xì)胞在24板中表達(dá)18D4的表達(dá)量無顯著差異，上清中抗體含量分別為1.2和1.4 μg/m L(圖3B)。 

為驗證線性表達(dá)框表達(dá)出的抗體是否具有功能性，我們把線性表達(dá)框表達(dá)、質(zhì)粒表達(dá)及純化后的18D4以及一個無關(guān)抗體20E3稀釋到相同濃度1.2μg/m L，通過ELISA檢測了線性表達(dá)框和質(zhì)粒表達(dá)的18D4抗體是否對滅活的漢城病毒L99具有相同的結(jié)合特異性。結(jié)果顯示2種表達(dá)方式表達(dá)的18D4抗體對抗原的結(jié)合特異性基本一致，說明線性表達(dá)框所表達(dá)出的抗體不會改變其原有的活性（圖3C）。

2.4  表達(dá)從人外周血單個B細(xì)胞中分離的抗體VH和VL基因

 將構(gòu)建的130對輕、重鏈配對的線性表達(dá)框轉(zhuǎn)染24孔板中的懸浮細(xì)胞293E，150 r/min、5% CO2、37C培養(yǎng)72 h，離心收集上清，分別通過Western印跡和ELLSA進(jìn)行鑒定，共表達(dá)出120個抗體，線性表達(dá)框表達(dá)抗體率為92%左右，Western印跡分析顯示表達(dá)的抗體具有完整的輕、重鏈，表達(dá)的抗體濃度為2～4 μg/m L的占10%左右，1～2 μg/m L的占60%左右，0.4～1μg/m L的占30%左右（圖4），結(jié)果顯示不同抗體間表達(dá)量存在一定的差異，可能與抗體本身的結(jié)構(gòu)相關(guān)。

3討論

 體外表達(dá)抗體基因，需要將抗體基因克隆到真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒中，表達(dá)質(zhì)粒上有CMV啟動子、抗體引導(dǎo)區(qū)序列、poly( A)信號序列、抗體重鏈或輕鏈恒定區(qū)序列。利用質(zhì)粒載體表達(dá)抗體需要構(gòu)建重組質(zhì)粒，篩選陽性克隆，進(jìn)行序列分析等，耗時長，TJ作量大，難以進(jìn)行高通量表達(dá)、篩選等工作，從而成為單個B細(xì)胞制備抗體技術(shù)的瓶頸。本研究利用分別帶有上述原件的有重疊序列的3個DNA片段，通過一步PCR構(gòu)建出線性的抗體基因表達(dá)框，不必將抗體輕、重鏈基因克隆進(jìn)表達(dá)載體，就可以實現(xiàn)抗體的表達(dá)。我們采用這種方法表達(dá)了針對漢城病毒L99株具有特異性的抗體18D4，并表達(dá)了從腎綜合征出血熱康復(fù)期患者外周血B細(xì)胞獲得的抗體基因。

 本研究所構(gòu)建的抗體基因線性表達(dá)框包含了表達(dá)功能性抗體所必需的所有重要原件，包括CMV啟動子、抗體引導(dǎo)區(qū)序列、Ig G1重鏈恒定區(qū)或輕鏈恒定區(qū)、poly(A)序列，以及通過PCR擴增出的抗體輕、重鏈的可變區(qū)基因。雖然不同來源的抗體基因序列會有所差異，但可以根據(jù)不同物種抗體基因序列特征設(shè)計不同的擴增引物，因此本實驗所建立的方法不僅適用于表達(dá)人源單克隆抗體，還可用來表達(dá)鼠源、馬源、猴源等非人源單克隆抗體。由于IgG1是最普遍的抗體亞型，考慮到方法的通用性，抗體重鏈表達(dá)框的恒定區(qū)選擇了IgG1的恒定區(qū)，而且有研究表明嵌合的IgG1抗體具有與親本抗體相同的特異性和相近的親和力。另外在本實驗中，利用線性表達(dá)框瞬時轉(zhuǎn)染293E細(xì)胞表達(dá)的18D4抗體與用質(zhì)粒表達(dá)的表達(dá)量基本相同，這也為篩選針對特定抗原的特異的中和抗體提供了更加高效便捷的手段。

 利用本研究建立的線性表達(dá)框的方法，結(jié)合單細(xì)胞RT-PCR技術(shù)，從腎綜合征出血熱康復(fù)期患者外周血中分選出單個B細(xì)胞，到表達(dá)出單克隆抗體，只用了5d的時間，很大程度上加快了實驗進(jìn)程。更重要的是，通過本實驗還證明我們可以做到高通量擴增抗體基因并表達(dá)出相對應(yīng)的抗體，為抗體高通量篩選和鑒定提供了理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。