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 王麗萍，徐傳遠(yuǎn)，常麗新，田亞紅

 華北理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院(唐山063000)

摘要  以小薊為原料，采用微波輔助法提取綠原酸。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以液料比、微波功率和提取時(shí)間為試驗(yàn)因素，以小薊中綠原酸得率為響應(yīng)值，利用響應(yīng)面分析法，確定了綠原酸提取的最佳工藝參數(shù)為液料比26：1(m L/g)、微波功率550 w、提取時(shí)間95 s，在此條件下從小薊中提取綠原酸的得率為2.81%，與預(yù)測(cè)值接近。

關(guān)鍵詞  響應(yīng)面；小薊；綠原酸：微波輔助

  綠原酸是一種重要的生物活性物質(zhì)，具有清除自由基、抗菌消炎、抗病毒、降糖、降脂、保肝利膽等多種功效。近年來發(fā)現(xiàn)綠原酸類物質(zhì)有抗癌、抗艾滋病的作用，可作為先導(dǎo)設(shè)計(jì)開發(fā)抗癌、抗艾滋病藥  物。同時(shí)，綠原酸還可作為食品保鮮劑、食品添加劑、植物生長(zhǎng)激素及一些高級(jí)化妝品的添加劑等，是食品、藥品、化妝品等工業(yè)的重要原料。因此，綠原酸被稱為植物黃金。

 小薊（Cirsium setosum）又名刺薊菜、刺兒菜、青青菜、萋萋菜等，多年生草本，分布于中國(guó)大部分地區(qū)。小薊性涼、味甘、苦，歸心、肝經(jīng)，具有涼血止血、祛瘀消腫功能，為血淋、尿血要方“小薊飲子”之君藥�，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，小薊還具有抗腫瘤、降血壓、治療敗血癥等功效。小薊中的有效成分比較復(fù)雜，含黃酮類、有機(jī)酸類、甾體類等化合物，其中綠原酸是小薊促進(jìn)血液凝固，止血的主要功效成分之一。目前已有研究者測(cè)定了不同產(chǎn)地的小薊中的綠原酸含量，但是小薊中的提取工藝主要局限于多糖和黃酮的提取。

 采用微波輔助法從小薊中提取綠原酸，以期研究出最佳提取工藝，為小薊綠原酸的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

  1  材料與方法

  1.1材料、試劑與儀器

 小薊：采摘于華北理工大學(xué)校園，干燥粉碎后備用。

 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品：購(gòu)于中國(guó)藥檢中心(純度>98%)；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

 DNP-902電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海精宏儀器設(shè)備有限公司；752型紫外可見分光光度計(jì)：上海光譜儀器有限公司：JA-2003型電子分析天平：上海上平儀器公司；WG700SL23-K6格蘭仕微波爐：佛山市格蘭仕電器有限公司；FA100 4B電子天平：上海越平科學(xué)儀器有限公司；SH2-95B立式多用循環(huán)水真空泵：上海予英儀器有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠。

  1.2試驗(yàn)方法

  1.2.1綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

 精確稱取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品2 mg，用無水乙醇溶解并定容于50 m L的容量瓶中。用移液管準(zhǔn)確吸取0.5，1，1.5,2，2.5和3 m L上述標(biāo)準(zhǔn)溶液于6支試管中，用無水乙醇定容至10 m L，即將母液配成2，4，6，8，10和12 μg/m L標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后用紫外可見分光光度計(jì)在327 nm波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度。最后以樣品的濃度C(μg／m L)為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并擬合回歸方程。

  1.2.2樣品綠原酸含量的測(cè)定

 樣品綠原酸含量的測(cè)定：綠原酸經(jīng)提取后，采用95%乙醇沉淀，離心得到上清，取適量稀釋，定容后于327 nm處測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中綠原酸的得率。

1.2.3單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

 以綠原酸得率為指標(biāo)，準(zhǔn)確稱取小薊粉末1.000 0g．選取粒度、液料比、微波功率和提取時(shí)間作為影響小薊綠原酸得率的單因素，每個(gè)因素選取5個(gè)水平，每組試驗(yàn)重復(fù)3次，取其平均值。

1.2.4工藝優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，利用響應(yīng)面分析方法對(duì)小薊綠原酸提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。

2結(jié)果與討論

2.1綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

2.2單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1粒度對(duì)小薊綠原酸得率的影響

 準(zhǔn)確稱取小薊粉末1.000 g，在液料比為25：1( m L/g)，微波功率400 W，微波時(shí)間為90 s條件下，分別研究40，60，80，100和120目大小對(duì)小薊綠原酸得率的影響。結(jié)果如圖2所示，小薊粉末粒度為80目時(shí)，綠原酸的得率最高，但隨著粒度的進(jìn)一步減小，綠原酸的得率反而下降。這說明小薊粉末的顆粒越小，里面的物質(zhì)溶出越多，使得溶液的黏度越大，影響傳質(zhì)，因而不利于綠原酸的提取。因此選擇最佳粒度為80目。

2.2.2液料比對(duì)小薊綠原酸得率的影響 

準(zhǔn)確稱取小薊粉末1.000 g，在粒度為80目，微波功率400 W，微波時(shí)間為90 s條件下，分別研究液料比為10：1.15：1，20：1，25：1和30：1（m L/g）對(duì)小薊綠原酸得率的影響。結(jié)果如圖3所示，當(dāng)液料比為25：1（m L/g）時(shí)，綠原酸得率達(dá)到峰值，當(dāng)液料比增至30：1(m L/g)時(shí)，綠原酸得率略有下降，這說明一定范圍內(nèi)萃取劑的量越大越有利于綠原酸的萃取，當(dāng)液料比達(dá)到一定值時(shí)，綠原酸的溶出量已經(jīng)達(dá)到最大限度，此時(shí)液料比繼續(xù)增大，對(duì)提高綠原酸得率意義不大。況且過大的液料比造成資源的浪費(fèi)，增加后續(xù)處理的困難。因此選擇液料比為25：1(m L／ g)。

2.2.3微波功率對(duì)小薊綠原酸得率的影響

  準(zhǔn)確稱取小薊粉末1.000 g，在粒度為80目，液料比為25：1(m L/g)，微波時(shí)間為90 s條件下，分別研究微波功率為100，250，400，550和700 W對(duì)小薊綠原酸得率的影響。結(jié)果如圖4所示。微波功率從100W增大到550 W的過程中，綠原酸得率迅速提高，這可能是由于微波功率在一定范圍內(nèi)時(shí)，隨著微波功率的增大，體系吸收的能量增加，分子運(yùn)動(dòng)加劇，有利于物質(zhì)的溶出，使得綠原酸得率提高；但微波功率過大時(shí)，會(huì)引起體系局部高溫，不穩(wěn)定的綠原酸的鄰二酚羥基結(jié)構(gòu)易被氧化分解，從而使得率下降。因此選擇550 W為最佳微波功率。

2.2.4提取時(shí)間對(duì)小薊綠原酸得率的影響

  準(zhǔn)確稱取小薊粉末1.000 g，在粒度為80目，液料比為25：1(m L/g)，微波功率550 W條件下，分別研究30，60，90，120和150 s對(duì)小薊綠原酸得率的影響。

  結(jié)果如圖5所示，微波提取時(shí)間從30 s增大到90 s的過程中，綠原酸得率迅速增大，這可能是由于隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，微波輻射更充分，使得綠原酸得率增大；但微波作用過長(zhǎng)時(shí)，會(huì)引起體系溫度過高，造成綠原酸的分解，從而使得率下降。因此選擇90 s為最佳微波提取時(shí)間。

2.3響應(yīng)面法優(yōu)化

  依據(jù)Box-Be hnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以液料比、微波功率和提取時(shí)間為自變量，以綠原酸的得率為響應(yīng)值，采用三因素三水平響應(yīng)面分析法來優(yōu)化綠原酸的最佳提取工藝。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表1。

 用Design-Expert 8.0.6.1軟件對(duì)表1的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，其方差分析結(jié)果見表2，并對(duì)響應(yīng)值與各個(gè)因素進(jìn)行回歸擬合，其擬合方程為：

 由表2的方差分析可知，模型的p<0.01，差異極顯著，失擬項(xiàng)p=0.054 2，為不顯著，R2=0.988 9．R2adj=0.934 0，以上參數(shù)說明回歸模型擬合程度較好，試驗(yàn)誤差小，可以用該模型對(duì)微波輔助提取小薊綠原酸的得率進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

從F值可知，各因素對(duì)小薊綠原酸得率的影響順序?yàn)椋篊>B>A，即提取時(shí)間>微波功率>液料比，一次項(xiàng)B和C為極顯著，交互項(xiàng)BC表現(xiàn)為極顯著，AB. AC表現(xiàn)為不顯著，二次項(xiàng)A2、B2和C2極顯著，說明二次項(xiàng)響應(yīng)值對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響很大，不是簡(jiǎn)單的一次線性關(guān)系。兩因素交互作用對(duì)綠原酸得率的影響如圖6所示。

 由圖6可知，響應(yīng)面開口向下，表明在一定范圍類，隨著各個(gè)因素的增大，響應(yīng)值增大；當(dāng)達(dá)到最大響應(yīng)值后，隨著每個(gè)因素的增大，響應(yīng)值逐漸減小。相比較而言，B與C響應(yīng)面較陡，A與B次之，A與C比較平緩。交互作用響應(yīng)面圖顯示，B與C的交互作用對(duì)綠原酸提取率有極顯著的影響，而A與B、A與C的交互作用對(duì)綠原酸提取率無顯著影響。

2.4驗(yàn)證試驗(yàn)

 利用Design Expert 8.0.6.1軟件進(jìn)行工藝參數(shù)的優(yōu)化組合，可得小薊綠原酸提取的最佳工藝條件為液料比26：1(m L/g)，微波功率519.90 W，提取時(shí)間95.58s，在該條件下小薊綠原酸得率預(yù)測(cè)值為2.79%�？紤]實(shí)際操作的可行性，將上述最佳條件修正為液料比為26：1(m L/g)，微波功率550 W，提取時(shí)間95s，經(jīng)過3次重復(fù)試驗(yàn)，得到小薊綠原酸得率的平均值為2.81%，與預(yù)測(cè)值接近。

3結(jié)論

 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法對(duì)微波輔助提取小薊綠原酸的工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化，并建立了合理可靠的二次多項(xiàng)模型。在液料比為26：1(m L/g)，微波功率550 w，提取時(shí)間95 s的條件下，小薊綠原酸得率達(dá)到2.81%。該研究為綠原酸的工業(yè)化生產(chǎn)提供有效的理論依據(jù)，為中藥材資源的進(jìn)一步開發(fā)利用起到積極的促進(jìn)作用。