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 劉國1，李海龍2，邊軍英1

1．浙江亞林生物科技股份有限公司（杭州311400）；2．中國林業(yè)科學(xué)研究院松花粉研究開發(fā)中心（杭州311400）

摘要研究乳酸菌發(fā)酵花粉產(chǎn)物進(jìn)行冷凍干燥時(shí)的保護(hù)策略。通過單一保護(hù)劑篩選和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，得到最佳的復(fù)合保護(hù)劑：乳清蛋白粉50、海藻糖6%、木糖醇1%。環(huán)境溫度脅迫處理的影響研究表明，冷脅迫和熱脅迫可提高乳酸茵的凍干存活率。優(yōu)化后的綜合保護(hù)工藝為：發(fā)酵結(jié)束后，加入上述復(fù)合保護(hù)劑，升溫至45℃熱處理30 min，然后降溫至8℃冷處理90 min，真空冷凍干燥后乳酸茵存活率達(dá)到94.7%。凍干品在4℃下貯存60 d，存活率為81%。

關(guān)鍵詞  乳酸菌；冷凍干燥；保護(hù)：存活率

  花粉以其豐富的營養(yǎng)元素和廣泛的藥用價(jià)值受到人們的重視，并得到廣泛的開發(fā)利用。蜂花粉具有抗衰老作用、降血脂、抗前列腺增生、提高免疫力、抗輻射、抗癌、促進(jìn)生長發(fā)育、對(duì)心血管系統(tǒng)具有保護(hù)作用等一系列有益功效。經(jīng)衛(wèi)生部和國家衛(wèi)生計(jì)生委（現(xiàn)國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)）批準(zhǔn)可用于食品的花粉有油菜花粉、玉米花粉和向日葵花粉等8種之多。

  但蜂花粉一般有著自身的不良腥味，食之口感苦澀，為許多人所不能接受。用乳酸菌發(fā)酵花粉，是解決花粉口感不佳的途徑之一。目前，發(fā)酵花粉的研究多集中在固態(tài)發(fā)酵和花粉飲料的制備方面。固態(tài)發(fā)酵中益生菌增殖有限，處理效果不理想，并且難以實(shí)現(xiàn)純培養(yǎng)條件和規(guī)�；�生產(chǎn)�；ǚ垡后w飲料存在運(yùn)輸費(fèi)用高、貨架期短和需求人群難以大量服用的缺點(diǎn)。乳酸菌發(fā)酵花粉固態(tài)活菌制劑可彌補(bǔ)上述的不足，冷凍干燥因其較好的細(xì)胞生存率成為該類產(chǎn)品的干燥首選方法。

  目前的凍干保護(hù)研究以乳酸菌發(fā)酵劑的干燥保護(hù)為主，同時(shí)兼顧食品風(fēng)味品質(zhì)和乳酸菌存活量的報(bào)道則較為鮮見。發(fā)酵花粉的干燥以活菌高存活率為目標(biāo)，同時(shí)需考慮花粉的主體地位，添加物不能對(duì)花粉的比例產(chǎn)生過大的稀釋。其凍干過程與只關(guān)注活菌數(shù)的凍干菌粉發(fā)酵劑和其他非微生態(tài)食品原材料的凍干都有所不同。試驗(yàn)對(duì)乳酸菌發(fā)酵花粉的冷凍干燥保護(hù)策略進(jìn)行研究和探討，以期對(duì)益生菌發(fā)酵處理食品原料的活菌型制劑開發(fā)有所幫助。

1  材料與方法

1.1材料與設(shè)備

1.1.1材料

 植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）：河北一然生物科技有限公司；蜂花粉：河南省長葛市睿蜂坊蜂業(yè)有限公司；其它材料為分析純或市售食品級(jí)。

1.1.2設(shè)備

LDZX-75KBS型立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-1C超凈工作臺(tái)：蘇州凈化；恒溫恒濕培養(yǎng)箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；通用發(fā)酵罐：鎮(zhèn)江東方生物工程設(shè)備技術(shù)有限責(zé)任公司；VFD-2000型冷凍干燥機(jī)：北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1工藝流程

 滅菌花粉→發(fā)酵基質(zhì)→發(fā)酵成發(fā)酵液→加入保護(hù)劑→脅迫處理→凍干成凍干品→活菌計(jì)數(shù)

1.2.2真空冷凍干燥

 將待干燥懸液倒人盤中，鋪成薄層，-30℃預(yù)凍，充分凍結(jié)后，真空冷凍干燥36 h，得到凍干樣品，干燥后期控制擱板溫度不高于30℃。

1.2.3乳酸菌活菌數(shù)的測(cè)定方法及存活率計(jì)算

 取1 m L待測(cè)發(fā)酵液或粉末懸浮液，用無菌生理鹽水進(jìn)行10倍梯度稀釋，選擇適當(dāng)?shù)南♂尪�，吸�?.1m L滴于MRS平板培養(yǎng)基，涂布均勻，每稀釋度至少做3個(gè)平行。置培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)48 h，對(duì)菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)，取平均值。

  按公式(1)計(jì)算原樣品活菌總數(shù)。

2結(jié)果與分析

2.1單一保護(hù)劑的對(duì)存活率的影響

 冷凍干燥會(huì)對(duì)細(xì)胞造成一定的生理損傷，使細(xì)胞存活率下降，主要表現(xiàn)為凍結(jié)過程中冰晶的機(jī)械損傷、引起的溶質(zhì)損傷、冷凍干燥前后細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)、功能及成分的變化、關(guān)鍵酶失活、DNA結(jié)構(gòu)的變化等。向樣品中加入凍干保護(hù)劑可有效降低凍干過程中對(duì)細(xì)胞造成的損傷。常用的保護(hù)劑有糖類、多元醇類、氨基酸類、聚合物、鹽類和甲胺等。

 選取脫脂乳、乳清粉、乳清蛋白粉、蔗糖、海藻糖、木糖醇、甘油和谷氨酸等作為保護(hù)劑，分別以4%的添加量考察對(duì)乳酸菌的凍干保護(hù)效果，結(jié)果見圖1。

 所考察的保護(hù)劑對(duì)凍干過程中乳酸菌均有一定的保護(hù)作用。其中脫脂乳、乳清蛋白粉、蔗糖、海藻糖和木糖醇效果較好，細(xì)胞存活率在30%以上�？紤]到脫脂乳對(duì)產(chǎn)品自有風(fēng)味影響較大，蔗糖甜度較高，試驗(yàn)選擇乳清蛋白粉、海藻糖、木糖醇進(jìn)行進(jìn)一步研究。

 在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，加入木糖醇的試驗(yàn)組凍干成品花粉塊結(jié)構(gòu)致密、質(zhì)地較硬，凍干所需的時(shí)間也長于其他組。進(jìn)一步的試驗(yàn)表明，為了避免干燥樣品板結(jié)情況的發(fā)生，加入木糖醇的量不宜高于1%。

 對(duì)乳清蛋白粉和海藻糖進(jìn)行不同添加量的試驗(yàn)，結(jié)果見圖2。在所選范圍內(nèi)，加大保護(hù)劑的添加量有利于細(xì)胞的存活。脫鹽乳清粉的比例達(dá)到4%，海藻糖比例達(dá)到6%時(shí)，加大添加量，存活率的提高幅度不大。

2.2復(fù)配保護(hù)劑及配比的確定

 冷凍干燥時(shí)，乳清蛋白能在菌體外形成蛋白膜，對(duì)細(xì)胞加以保護(hù)，并可固定凍干酶類，其中的其它成分也可提高菌體的冷凍干燥存活率，并為凍干物提供輕而多孔的結(jié)構(gòu)。海藻糖對(duì)細(xì)胞有很好保護(hù)作用。目前，主要有2種假說解釋海藻糖保護(hù)機(jī)制：一種稱為“水替代”假說，該假說認(rèn)為海藻糖所含羥基基團(tuán)的氫鍵結(jié)合到膜的磷酸基團(tuán)和蛋白質(zhì)極性基團(tuán)，取代了結(jié)晶水，形成一層保護(hù)膜以代替失去的結(jié)構(gòu)水膜；另一種稱為“玻璃態(tài)”假說，認(rèn)為海藻糖的重要作用是形成玻璃態(tài)結(jié)構(gòu)保護(hù)層。

 木糖醇具有較多的羥基官能團(tuán)，能產(chǎn)生“優(yōu)先水化作用”以及改變體系的玻璃態(tài)轉(zhuǎn)變溫度等，故可發(fā)揮較好的細(xì)胞保護(hù)作用。研究表明，玻璃態(tài)的糖醇可以阻止冷凍干燥及隨后的貯藏過程中乳酸脫氫酶活性的喪失，并可以保護(hù)牛血清白蛋白免于凍干造成的次級(jí)結(jié)構(gòu)的改變。與還原性和非還原性二糖相比，玻璃態(tài)糖醇能表現(xiàn)出更低的美拉德反應(yīng)敏感性，故是理想的凍干保護(hù)劑之一。

  基于單一保護(hù)劑的試驗(yàn)結(jié)果，試驗(yàn)建立3因素3水平的正交試驗(yàn)L9(33)確定乳清蛋白粉、海藻糖和木糖醇3種保護(hù)劑的最佳復(fù)合配方，正交設(shè)計(jì)表及試驗(yàn)結(jié)果見表1和2。

 結(jié)果表明，在試驗(yàn)范圍內(nèi)，影響發(fā)酵花粉中益生菌凍干后存活率的因素主次順序?yàn)椋汉Ｔ逄?#62;乳清蛋白粉>木糖醇。所得到的最佳復(fù)配保護(hù)劑組合為：乳清蛋白粉5%、海藻糖6%、木糖醇1%，其保護(hù)作用下發(fā)酵花粉凍干品中乳酸菌的存活率可達(dá)84.1%。

2.3環(huán)境脅迫對(duì)存活率的影響

 已有的研究發(fā)現(xiàn)，一定的環(huán)境脅迫條件可以提高微生物的干燥存活率。溫度脅迫是眾多脅迫中最常見的，溫度脅迫分為冷脅迫和熱脅迫兩種。Java等通過熱脅迫和滲透壓脅迫提高了鼠李糖乳酸桿菌HNO01的凍干活性。Ziadi等通過熱脅迫處理提高了乳酸乳球菌的冷凍干燥活力。陸英對(duì)干酪乳桿菌DB-II進(jìn)行了熱脅迫處理，通過50℃、45 min的處理其活力提高

了2.11倍。李寶坤的研究表明冷脅迫和熱脅迫對(duì)羅伊氏乳酸桿菌CICC6226的冷凍干燥存活率都有一定程度提高，并揭示其作用機(jī)制可能是提高了細(xì)胞膜的流動(dòng)性和完整性。

  試驗(yàn)對(duì)乳酸菌的花粉發(fā)酵物進(jìn)行冷處理和熱處理，考察環(huán)境溫度脅迫對(duì)所含兩種乳酸菌的冷凍干燥存活率的影響，結(jié)果分別見圖3和圖4。

 結(jié)果表明，適當(dāng)?shù)睦涿{迫和熱脅迫對(duì)花粉中乳酸菌的存活率有正面作用。其中冷脅迫以8℃處理90min較好，存活率提高了5%。熱脅迫以45℃處理30min較好，存活率提高了6.1%。熱處理溫度達(dá)到50℃已對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生了損傷，存活率下降。

  有研究表明，冷脅迫和熱脅迫之間可能存在著交叉保護(hù)的機(jī)制，Spano等對(duì)植物乳桿菌進(jìn)行脅迫處理發(fā)現(xiàn)，冷處理也會(huì)誘導(dǎo)熱脅迫相關(guān)基因的表達(dá)。為了獲得更強(qiáng)的應(yīng)激效果，試驗(yàn)對(duì)冷脅迫和熱脅迫手段依次應(yīng)用的聯(lián)合脅迫進(jìn)行考察。試驗(yàn)結(jié)果表明，“冷一熱”處理使存活率略有降低，而“熱一冷”處理，存活率相對(duì)于未經(jīng)脅迫組提高了10.6%，達(dá)到94.7%。  “冷一熱”的處理方式，由培養(yǎng)結(jié)束時(shí)的37℃降至8℃，后又升至45℃的大溫差冷熱交替，可能造成了部分細(xì)胞的死亡或損傷，導(dǎo)致存活率下降。“熱一冷”的處理方式環(huán)境溫度變化相對(duì)溫和，未對(duì)細(xì)胞造成不可修復(fù)的損傷，其中的熱脅迫處理與趙建新等進(jìn)行的42℃預(yù)培養(yǎng)40 min的方法有著異曲同工的作用。李寶坤通過檢測(cè)LDH和ATP酶的活力，證實(shí)了預(yù)培養(yǎng)可提高凍干后細(xì)胞膜的完整性，有利于細(xì)胞膜流動(dòng)性和通透性的維持。

2.4貯存溫度對(duì)存活率的影響

對(duì)活菌型制劑而言，貯存期內(nèi)的活菌存活率至關(guān)重要。貯藏條件中的溫度、濕度和光照等眾多因素都會(huì)對(duì)細(xì)胞的存活產(chǎn)生影響，而溫度則是其中最為關(guān)鍵的因素之一。試驗(yàn)對(duì)食品日常存貯較為常見的室溫和冷藏條件下的發(fā)酵花粉中乳酸菌存活率進(jìn)行考察。室溫組為樣品密封包裝后放置于室內(nèi)（試驗(yàn)季節(jié)下室溫約15℃～25℃），冷藏組為4 ℃冰箱冷藏，每10 d進(jìn)行活菌數(shù)檢測(cè)，計(jì)算存活率，結(jié)果見圖5。冷藏條件下貯存2個(gè)月后，乳酸菌的存活率仍有80%以上，而室溫下樣品下降到34%。

3結(jié)論與展望

 通過對(duì)凍干保護(hù)劑的篩選，結(jié)合乳酸菌發(fā)酵花粉對(duì)風(fēng)味的要求，得到較優(yōu)的保護(hù)劑為乳清蛋白粉、海藻糖和木糖醇。正交優(yōu)化試驗(yàn)表明，最佳的復(fù)合保護(hù)劑為乳清蛋白粉5%、海藻糖6%、木糖醇1%�；ǚ郯l(fā)酵結(jié)束后，加入復(fù)合保護(hù)劑，先進(jìn)行45℃熱脅迫應(yīng)激處理30 min，再降溫至8℃冷脅迫處理90 min，然后進(jìn)行冷凍干燥，凍干品中植物乳桿菌和嗜酸乳桿菌的存活率達(dá)到95%左右。在室溫和4℃冷藏條件下，凍干品存貯60 d后的乳酸菌存活率分別為34%和81%，有著較好的存貯穩(wěn)定性。

 益生菌對(duì)人體的有益作用已為人們所熟知，各種乳酸菌活菌型產(chǎn)品在市場(chǎng)上深受人們的喜愛。用益生菌處理各種食品材料，得到具有新型風(fēng)味和健康功效的食品加工技術(shù)方興未艾。該類產(chǎn)品以食用材料為主體，含有數(shù)量龐大的益生菌，其干燥過程除考慮獲得益生菌的最高存活率外，還需兼顧食品自身的風(fēng)味等因素，這對(duì)保護(hù)劑的選用和添加量有所限制。采用具有較高抗逆性的菌種、結(jié)合具體產(chǎn)品選擇合適的保護(hù)劑、充分發(fā)揮微生物的環(huán)境脅迫應(yīng)激機(jī)制等方法的綜合運(yùn)用是得到適宜干燥工藝的有效途徑。