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 張慧敏1，李遠(yuǎn)志2

 1．內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)職業(yè)技術(shù)學(xué)院（包頭014109）；2華南農(nóng)業(yè)大學(xué)（廣州51 0642）

摘要探討了青梅汁的體外抗氧化作用。采用化學(xué)模擬體系對(duì)其總抗氧化能力，清除．OH、DPPH.及O2-的能力進(jìn)行測(cè)定：通過體外動(dòng)物試驗(yàn)，研究了青梅汁對(duì)37℃孵育后H2O2誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的溶血的影響。結(jié)果表明，60Brix青梅汁的總抗氧化能力為362 U/m L，強(qiáng)于1.0 mg/m L的VC，BHA和BHT，同時(shí)對(duì).OHO2-·及DPPH．具有較強(qiáng)的清除能力，且可抑制MDA的產(chǎn)生和紅細(xì)胞溶血。說明青梅汁具有較強(qiáng)的抗氧化能力。

關(guān)鍵詞  青梅汁；抗氧化特性

  青梅果實(shí)風(fēng)味獨(dú)特，酸度高，且具有很高的營(yíng)養(yǎng)保健價(jià)值，除含有豐富的碳水化合物、蛋白質(zhì)、氨基酸、有機(jī)酸、礦物質(zhì)和維生素外，還有豐富的黃酮和多酚類等生理活性成分。青梅中的含有的硫化合物可抑制脂質(zhì)過氧化物對(duì)膜結(jié)構(gòu)的損傷，具有保護(hù)肝臟的作用。這些物質(zhì)可作為還原劑、自由基清除劑等成分而終止自由基的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。

 近代醫(yī)學(xué)進(jìn)一步證明，青梅除具有抗菌、防止便秘、提高食欲、止瀉等功效外，同時(shí)對(duì)高血壓、心血管病等也有一定的療效，還有防癌、治癌的功效。

 國(guó)內(nèi)外大量的研究報(bào)道已證實(shí)許多植物及其提取物具有較強(qiáng)的清除人體內(nèi)氧自由基，延緩衰老的作用。試驗(yàn)擬通過化學(xué)模擬和體外動(dòng)物試驗(yàn)兩種體系對(duì)青梅汁體外抗氧化作用進(jìn)行初步研究，以期通過研究促進(jìn)青梅消費(fèi)，并為青梅保健食品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1  材料與方法

1.1材料

 青梅：試驗(yàn)所用青梅原料來自廣東從化，收獲季節(jié)采收，果實(shí)成熟度為八成熟。

 動(dòng)物：昆明種小白鼠，雄性，體重20+2 g，由廣東省試驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

 試劑：1，1-二苯基-2-苦基苯肼（1，l-Diphenyl-2-picryl-hydrazyl，DPPH）購(gòu)自Sigma公司；總抗氧化能力( TAC)試劑盒和丙二醛(MDA)試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供；DPPH，日本東京化成株式會(huì)社；丁基羥基茴香醚( BHA)，二丁基羥基甲苯( BHT)等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2儀器與設(shè)備

 UV-1700型紫外可見分光光度計(jì)：日本島津公司；H.S.G.-IIB4電熱恒溫水浴鍋：上海儀表（集團(tuán)）供銷公司；Himac CR21G高速冷凍離心機(jī)：日本日立公司；FA1104型電子天平：上海天平儀器廠。

1.3試驗(yàn)原理與方法

1.3.1青梅汁的制備

 青梅→選果→清洗→熱燙→打漿去核→酶處理→滅酶→離心( 3 000 r/min) →超濾→備用

1.3.2青梅汁總抗氧化能力(TAC)測(cè)定

 11測(cè)定原理：抗氧化物質(zhì)能使Fe3+還原成Fe2+，F(xiàn)e2+和鄰二氮菲結(jié)合物質(zhì)形成穩(wěn)固的絡(luò)合物，通過比色測(cè)定絡(luò)合物Fe2+-鄰二氮菲含量變化，可了解溶液的氧化還原狀態(tài)，從而推知體系的總抗氧化能力。

 2)測(cè)定方法：按南京建成生物工程研究所TAC測(cè){定試劑盒說明書。 

 總抗氧化能力的定義為：37℃時(shí)，每分鐘每毫升液體使反應(yīng)體系的吸光度( OD)每增加0.01時(shí)，為一個(gè)總抗氧化能力單位(U)�？偪寡趸�能力表示為U/m L，取樣及測(cè)定重復(fù)均為3次。

1.3.3清除．OH能力的測(cè)定

  1)測(cè)定原理：Fenton反應(yīng)是生物體內(nèi)產(chǎn)生．OH的主要反應(yīng)，其反應(yīng)式可表示為Fe2++H2O2→Fe3++OH-+·OH，用比色法測(cè)定Fenton反應(yīng)體系產(chǎn)生的．OH，其中鄰菲羅啉_Fe2+是該反應(yīng)中的一種常用的氧化還原指示劑，其顏色變化可敏銳的反映溶液氧化還原狀態(tài)的改變，如果向反應(yīng)中加入．OH的清除劑，則．OH減少，同時(shí)Fe2+增多，溶液顏色變紅，由此可

推算．OH的清除劑對(duì)．OH的清除效率。

  2)測(cè)定方法：采用H202/鄰二氮菲-Fe2+分光光度法，400 m mol/L，pH 7.4的磷酸緩沖液(PBS)，

2.5 m mol/L的鄰菲羅啉水溶液，2.5 m mol/L的硫酸亞鐵( FeSO4)水溶液，20 m mol/L的H2O2水溶液，按表1加樣，反應(yīng)在37℃恒溫水浴中進(jìn)行，1.5 h后測(cè)定536 nm處的吸光度（A）。按式(2)計(jì)算樣品對(duì)．OH的清除率。

1.3.4清除O2-·能力的測(cè)定

  采用鄰苯三酚自氧化法，pH 8.2的100 m mol/LTris-HCl緩沖液含2 m mol/L的EDTA，3 m mol/L鄰苯三酚溶液用10 m mol/L HC1配制，按表2加樣，迅速搖勻倒入比色杯中，在320 nm下，每隔30 s測(cè)一次吸光度。反應(yīng)時(shí)間為4 min，滯后30 s。計(jì)算每分鐘吸光度的增值（AA/min），空白對(duì)照管的結(jié)果為鄰苯三酚的自氧化速率。對(duì)照的自氧化速率需控制在0.06 0D/min～0.08 0D/min。清除率按式(3)計(jì)算。

1.3.5清除DPPH．能力的測(cè)定

 采用Fenglin的檢測(cè)方法改進(jìn)后進(jìn)行，DPPH．乙醇溶液濃度為2.0×10-4 m mol/L，按表3加樣，反應(yīng)30 min后，用分光光度計(jì)在517 nm處測(cè)定各吸光度（A），蒸餾水調(diào)零，清除率按式(4)計(jì)算：

1.3.6 H2O2誘導(dǎo)的MDA含量的測(cè)定

 1)肝組織勻漿的制備：小鼠頸椎脫臼致死，迅速分離出肝組織，用冷的生理鹽水洗凈后稱重，冰浴下勻漿，制成10%的懸浮液，3 000 r/min 4℃離心后取上清液分裝，4℃保存?zhèn)溆谩?

 2)取肝勻漿上清液1.2 m L，分別加入6 0Brix青梅汁與1 mg/m L VC，BHA和BHT，陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照均以0.2 m L的0.05 mol/L pH 7.4的磷酸鹽緩沖液代替，37℃水浴孵育15 min后，除了陰性對(duì)照加0.2 m L上述磷酸鹽緩沖液外，其余各組均加入0.2 m L 50 m mol/

L H2O2，在37℃水浴孵育45 min，冰浴10 min終止反應(yīng)，然后4℃3 000 r/min離心10 min，取上清液，按試劑盒說明書測(cè)定MDA含量。

31 MDA含量計(jì)算公式：

1.3.7 H2O2誘導(dǎo)紅細(xì)胞氧化溶血的測(cè)定

 1)紅細(xì)胞懸浮液的制備：小鼠眼眶取血，肝素抗凝，4 0C 3 000 r/min離心得紅細(xì)胞，冷生理鹽水洗3次，制成0.5%懸浮液。

 2)分別取紅細(xì)胞懸液0.4 m L，加入60Brix青梅汁與l mg/m L VC，BHA和BHT（以0.2 m L 0.05 mol/L pH7.4的磷酸鹽緩沖液作為陽(yáng)性對(duì)照組），然后再加入0.2 m L的50 m mol/L H202啟動(dòng)反應(yīng)，37 0C作用1h，生理鹽水稀釋5倍，3 000 r/min離心10 min，取上清液測(cè)A415nm，按式(6)和(7)計(jì)算溶血度和抑制率。

1.4數(shù)據(jù)分析

  測(cè)定結(jié)果以平均數(shù)（n=3）±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，采用DPS v2.00專業(yè)版統(tǒng)計(jì)軟件，用單因素方差分析( ANOVA)進(jìn)行多組之間均數(shù)的差異性檢驗(yàn)。

2結(jié)果與分析

2.1青梅汁總抗氧化能力測(cè)定

 采用試劑盒法測(cè)定青梅汁(60Brix)總抗氧化能力，并與1.0 mg/m L的VC，BHA和BHT進(jìn)行比較，結(jié)果見圖1。從圖1可以看出，總抗氧化能力大小為：青梅汁>VC>BHA>BHT。說明青梅汁具有較強(qiáng)的抗氧化能力。

2.2青梅汁對(duì)．OH的清除能力

 羥自由基(．OH)是已知的最活潑的活性氧自由基，也是毒性最大的氧自由基。它可與活細(xì)胞中的任何分子發(fā)生反應(yīng)而造成損害，且反應(yīng)的速度極快，被破壞的分子遍及糖類、氨基酸、磷脂、核苷和有機(jī)酸等。青梅汁對(duì)fenton反應(yīng)產(chǎn)生的．OH的清除效果如圖2F示。圖2表明，60Brix青梅汁清除．OH的能力強(qiáng)于1.0 mg/m L VC,  1.0 mg/m L BHA和1.0 mg/m L BHT。

2.3青梅汁對(duì)O2-·的清除能力

 O2-·是所有氧自由基中的第一個(gè)自由基，可以經(jīng)過一系列反應(yīng)生成其他氧自由基，與許多疾病有密切的聯(lián)系，因此測(cè)定青梅汁對(duì)O2-·的清除作用具有重要的意義。

 鄰苯三酚在堿性條件下能夠迅速自氧化，釋放O2-.，加入清除劑后能夠清除其中的O2 ．，從而使鄰苯三酚的自氧化速率降低。6 0Brix青梅汁與VC清除清除O2-·能力的比較見圖3。由圖3可以看出，6 0Brix青梅汁對(duì)鄰苯三酚自氧化產(chǎn)生的O2-·具有一定的清除作用，1.0 mg/m L VC清除能力最強(qiáng)。試驗(yàn)中測(cè)定1.0mg/m L BHT和BHA對(duì)鄰苯三酚自氧化產(chǎn)生的O2-·清除能力，由于濃度太小，不能對(duì)O2-·得到有效的清除。

2.4不同濃度青梅汁對(duì)DPPH．的清除能力

 DPPH．是一種穩(wěn)定的自由基，其孤對(duì)電子在517nm附近有較強(qiáng)吸收。當(dāng)有清除劑存在時(shí)，吸收消失或減弱，測(cè)定吸收減弱的程度可以評(píng)價(jià)自由基清除劑的活性。不同濃度的青梅汁清除DPPH．的能力見圖4。

 從圖4可知，青梅汁(60Brix)對(duì)清除DPPH．的能力隨著濃度升高而增強(qiáng)。將6 0Brix青梅汁稀釋后，其清除DPPH．的能力降低，但當(dāng)稀釋倍數(shù)在10倍以下時(shí)，其清除DPPH．的能力下降幅度不大，稀釋10倍時(shí)，DPPH．的清除率從6 0Brix青梅汁的100%降到82.32%：但當(dāng)稀釋倍數(shù)進(jìn)一步增大時(shí)，其DPPH.的清除率則急劇下降，稀釋30倍時(shí)為41.42%，下降了

2.4倍。

2.5青梅汁與其它抗氧化劑清除DPPH．能力的比較

 VC, BHA和BHT是常用的抗氧化劑，且在食品領(lǐng)域已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用。因此，試驗(yàn)對(duì)這三種抗氧化劑對(duì)DPPH．的清除能力進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果如表4所示。

 從圖4和表4結(jié)果可以看出，60Brix青梅汁稀釋2倍的清除DPPH．能力接近于濃度為0.20 mg/m L抗壞血酸溶液，60Brix青梅汁稀釋10倍的清除DPPH．能力和0.15 mg/m L BHA溶液和0.10 mg/ml抗壞血酸溶液相當(dāng)，由此說明青梅汁具有很強(qiáng)的清除DPPH．能力。

2.6青梅汁對(duì)H2O2誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA生成的影響

  表5結(jié)果表明，陽(yáng)性對(duì)照組MDA的含量明顯高于陰性對(duì)照組。加入青梅汁，MDA生成量顯著減少，說明青梅汁可抑制生物體的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，進(jìn)而減少終產(chǎn)物丙二醛( MDA)的生成，且抑制作用隨濃度的增大而增強(qiáng)。

2.7青梅汁對(duì)H2O2誘導(dǎo)紅細(xì)胞氧化溶血的抑制作用

  表6的數(shù)據(jù)表明，不同濃度的青梅汁對(duì)H2O2誘導(dǎo)的紅細(xì)胞氧化溶血均有顯著的抑制作用，表明青梅汁可抑制生物體的氧化損傷，保護(hù)紅細(xì)胞膜，且抑制作用隨濃度的增大而增強(qiáng)。

3討論

  現(xiàn)已證明與自由基有關(guān)的疾病有上百種，其中包括對(duì)人類威脅最大的心腦血管病和腫瘤，諸如老年癡呆、糖尿病、肺氣腫、白內(nèi)障及各種炎癥，甚至令人聞之變色的艾滋病都有自由基介導(dǎo)和參與的確切證據(jù)。

  生物體內(nèi)常見的自由基有：超氧陰離子自由基（O2-），羥基自由基(．OH)，烷氧基自由基

(RO．)等。O2-·形成最早，．OH作用最強(qiáng)，ROOH鏈鎖反應(yīng)循環(huán)最持久，一旦清除了O2-．，  . OH的形成即中斷，則可從根本上預(yù)防體內(nèi)形成過多的．OH和其他活性氧自由基，達(dá)到防癌、抗癌、抗心血管等疾病的目的。

 機(jī)體過量的自由基可以引發(fā)生物膜不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化，產(chǎn)生MDA和過氧化脂質(zhì)，它們的含量變化可定量反映生物膜的受損程度。膜的完整性受損，從而使膜的通透性增加，引起膜內(nèi)外物質(zhì)的外泄和內(nèi)流，造成如紅細(xì)胞溶血現(xiàn)象的發(fā)生。通過動(dòng)物試驗(yàn)證明，青梅汁具有防止膜脂質(zhì)過氧化的作用，顯著降低肝勻漿的自氧化與H2O2誘導(dǎo)氧化所產(chǎn)生的MDA以及紅細(xì)胞氧化溶血。

 結(jié)合化學(xué)體系試驗(yàn)結(jié)果，可充分說明，青梅汁具有較強(qiáng)的抗氧化作用，保護(hù)膜系統(tǒng)免受損傷。這對(duì)促進(jìn)青梅消費(fèi)，并為青梅保健食品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

 但由于試驗(yàn)僅是體外試驗(yàn)，而生物體內(nèi)的氧化代謝是極其復(fù)雜的，因此，有待于進(jìn)一步的研究青梅汁的抗氧化作用。

4結(jié)論

 通過化學(xué)模擬和體外動(dòng)物試驗(yàn)兩種體系對(duì)青梅汁體外抗氧化作用進(jìn)行初步研究，證明青梅汁具有較強(qiáng)的抗氧化能力。主要結(jié)論如下：

 1)采用試劑盒法測(cè)定青梅汁(60Brix)總抗氧化能力強(qiáng)于1.0 mg/m L的VC，BHA和BHT。

 2)青梅汁(6 0Brix)對(duì)Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的．OH的清除能力強(qiáng)于1.0 mg/m L VC，BHA和BHT。

 3)青梅汁(60Brix)對(duì)鄰苯三酚自氧化產(chǎn)生的O2-·具有一定的清除作用，VC清除能力最強(qiáng)。

 4)青梅汁(6 0Brix)對(duì)清除DPPH．的能力隨著濃度升高而增強(qiáng)，青梅汁(6 0Brix)稀釋2倍的清除DPPH．能力接近于濃度為0.20 mg/ml抗壞血酸溶液，青梅汁(6 0Brix)稀釋10倍的清除DPPH．能力和0.15mg/m L BHA溶液和0.10 mg/m L抗壞血酸溶液相當(dāng)，由此說明青梅汁具有很強(qiáng)的清除DPPH．能力。

  5)青梅汁可抑制生物體的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，進(jìn)而減少終產(chǎn)物丙二醛( MDA)的生成，且抑制作用隨濃度的增大而增強(qiáng)。

 6)不同濃度的青梅汁對(duì)H2O2誘導(dǎo)的紅細(xì)胞氧化溶血均有顯著的抑制作用，表明青梅汁可抑制生物體的氧化損傷，保護(hù)紅細(xì)胞膜，且抑制作用隨濃度的增大而增強(qiáng)。