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 張樂，  呂永康，  劉玉香，  孫明星

（1．太原理工大學化學化工學院；

2．太原理工大學煤科學與技術(shù)教育部和山西省重點實驗室；

3．太原理工大學環(huán)境科學與工程學院，山西太原030024）

 摘要：為探究光合細菌PB-Z產(chǎn)氫的最適產(chǎn)氫條件，在單因素實驗的基礎(chǔ)上，以鎂離子濃度、pH、反應(yīng)時間為實驗因素，以光合細菌PB-Z產(chǎn)氫量為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面分析法對實驗結(jié)果進行模擬及分析，建立了產(chǎn)氫量與3個自變量關(guān)系的二次多項式數(shù)學模型。結(jié)果表明，鎂離子濃度、pH值、反應(yīng)時間與產(chǎn)氫量存在顯著的相關(guān)性。確定光合細菌PB-Z的最佳產(chǎn)氫條件為：鎂離子濃度4.77 mmol/L，初始pH 7.05，反應(yīng)時間77.5 h。在此實驗條件下，產(chǎn)氫量為689.3 mL/L-培養(yǎng)基，與預(yù)測值相比偏差僅4.8%。說明響應(yīng)曲面法優(yōu)化光合細菌PB-Z的產(chǎn)氫條件是可行的。

 關(guān)鍵詞：光合細菌；鎂離子；pH；反應(yīng)時間；  響應(yīng)曲面法

 光合細菌(photosynthetic bacteria，PSB)是一類能以光合作用產(chǎn)能的水生微生物的總稱，其廣泛存在于自然界中，在海洋、河湖、富含有機質(zhì)的污泥中均有分布。光合細菌應(yīng)用廣泛，在食品、廢水處理、農(nóng)業(yè)、水產(chǎn)養(yǎng)殖、醫(yī)藥衛(wèi)生等領(lǐng)域均發(fā)揮著重大作用。光合細菌可利用體內(nèi)的光合結(jié)構(gòu)在利用有機物（有機廢水）的同時轉(zhuǎn)化光能為氫能，氫氣具有熱值高，燃燒產(chǎn)物清潔無污染等特點，被認為是21世紀最具應(yīng)用價值的可再生能源之一。目前，對光合細菌產(chǎn)氫條件優(yōu)化的研究有很多，主要有光強、溫度、碳源氮源種類及濃度、pH等，但是鎂離子濃度、pH、反應(yīng)時間對光合細菌產(chǎn)氫的影響及其相互作用的研究卻很少見，這些條件對光合細菌產(chǎn)氫起著重要的作用，具有很重要的現(xiàn)實意義。鎂離子是光合細菌體內(nèi)大量存在的元素之一，Lilit Hakobyan等認為，很多種光合色素例如細菌葉綠素( Bchl)都含有鎂離子，此外，鎂離子還是光合細菌細胞內(nèi)許多酶的活化劑，其對光合細菌產(chǎn)氫有著重要影響。本文利用從污水處理廠二沉池活性污泥中分離純化出來的光合細菌PB -Z為菌種，前期實驗發(fā)現(xiàn)，鎂離子濃度對該光合細菌PB-Z的產(chǎn)氫具有很大影響，因此，優(yōu)化光合細菌PB-Z的產(chǎn)氫條件為其進一步的開發(fā)應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)，為提高光合細菌產(chǎn)氫量及其后續(xù)的應(yīng)用研究創(chuàng)造條件。

1  材料與方法

1.1  實驗材料

  試驗用菌種：本文采用的高效產(chǎn)氫光合細菌菌種PB-Z是從太原河西北污水廠的二沉池活性污泥樣品中，進行菌種的富集、分離、純化后，篩選出的產(chǎn)氫效率相對較高的紫色非硫光合細菌，經(jīng)16S rDNA測序及同源性比較，鑒定為沼澤紅假單胞菌，菌液顏色為深紅色并有少量紅色沉淀，菌種活性良好。

 生長培養(yǎng)基：CH.3COONa - 3H20 3 g，NH4C1 0.5 g，MgCl2 -6H20 0.2 g,Na2HP04 -12H20 0.5 g,NaCl 2 g,蛋白胨lg，酵母膏0.2 g，微量元素溶液(g/L，MnS04．4H20 2.1,H.3BO:+ 2.8,ZnS04 - 7H20 0.248,FeS04 - 7H201.8，(NH4)6M07024-4H20 8)l mL。蒸餾水1 000 mL，pH=7。

 產(chǎn)氫培養(yǎng)基：C6H1206 12.6 g，CH4N20 0.6 g，MgCl2-6H20 0.2 g,NaCl l g,K2HP04·3H20 0.5 g，酵母膏0.2 g，微量元素溶液(g/L，MnS04·4H20 2.1，H3BO。2.8,ZnS04 - 7H20 0.248,FeS04 - 7H20  1.8, (NH4)6M07024.4H20 8)l mL。蒸餾水1 000 mL，pH=7。

1.2  實驗方法

1.2.1  實驗裝置

  本文實驗裝置如圖1，培養(yǎng)容器采用250 mL玻璃瓶，加入200 mL培養(yǎng)基，接種在生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h的種子液，接種量為20%。氫氣的收集采用排水集氣法，定時記錄產(chǎn)氫量。使用100 W的白熾燈作為光源，培養(yǎng)條件為溫度(30±2)℃，光強4 500 lux。

1.2.2  產(chǎn)氫條件研究

1.2.2.1  單因素實驗

 在200 mL液體產(chǎn)氫培養(yǎng)基中接種光合細菌菌液40 mL，使接種后菌液的OD660為(0.32+0.006)。設(shè)置pH為6、7、8、9，來分析其最適產(chǎn)氫pH值；在pH為7條件下，設(shè)置培養(yǎng)基鎂離子濃度為1、3、5、7 mmol/L，分析其最適鎂離子濃度與產(chǎn)氫量及產(chǎn)氫速率隨時間的變化規(guī)律。

1.2.2.2  響應(yīng)曲面實驗設(shè)計

選擇鎂離子濃度、pH、反應(yīng)時間3個因素作為響應(yīng)變量，以光合細菌的產(chǎn)氫量為響應(yīng)值，通過響應(yīng)曲面法分析進行產(chǎn)氫條件的優(yōu)化，得到最優(yōu)產(chǎn)氫條件。各實驗組的編碼與取值見表1，根據(jù)單因素實驗結(jié)果，最佳鎂離子濃度為5 mmol/L，故選擇鎂離子濃度為3、5、7 mmol/L;最佳pH為7，故選取pH值為6、7、8；產(chǎn)氫反應(yīng)在36 h時有最大的產(chǎn)氫速率，84 h后產(chǎn)氫量增長幅度很小，反應(yīng)時間過短則反應(yīng)不能充分進行，過長則造成設(shè)備的浪費和效率的降低，綜合考慮，選取反應(yīng)時間為36、60、84 h。

1.2.3  分析檢測方法

 菌密度的測定：采用分光光度計（SP-752，上海光譜）測定菌液在660 nm波長下的菌密度（OD660）。

 菌液pH的測定：采用Sartorius PB-10型酸度計。

 氫氣含量的測定：采用上海海欣色譜有限公司的GC-950型氣相色譜，色譜柱為TDX-01，載氣為氬氣。氫氣的測定采用外標法，進樣口溫度和檢測器溫度分別為120、150℃。

2  結(jié)果與分析

2.1  單因素實驗結(jié)果

2.1.1pH對產(chǎn)氫量的影響

  從圖2中可知，在pH為7時，光合細菌PB-Z累積產(chǎn)氫量達到最大，第108小時達到(641.7+13.5) mLH2/L-培養(yǎng)基，酸性條件和堿性條件均會影響光合細菌PB-Z的產(chǎn)氫量。這是由于酸性條件和堿性條件會影響光合細菌產(chǎn)氫相關(guān)酶的活性，使其活性降低，導致產(chǎn)氫量下降。

2 .1.2  鎂離子濃度與反應(yīng)時間對產(chǎn)氫量及產(chǎn)氫速率的影響

由圖3、4看出，鎂離子濃度從1 mmol/L增加到5 mmol/L過程中，隨著鎂離子濃度的增大，產(chǎn)氫量也隨之增加，當鎂離子濃度為5 mmol/L時，反應(yīng)器的累積產(chǎn)氫量達到最大，為(733.4+12.7) mL H2/L-培養(yǎng)基，當鎂離子濃度增大到7 mmol/L時，產(chǎn)氫量隨之減少（圖3）。Liu等和Lilit Hakobyan等認為，鎂離子參與了光合細菌許多色素和酶的合成，光合細菌產(chǎn)氫與光合色素和產(chǎn)氫相關(guān)酶有著重要的關(guān)系。一定濃度的鎂離子會促進產(chǎn)氫相關(guān)酶活性的提高和光合色素的合成，近而使光合細菌的產(chǎn)氫量得到提高。由圖4，當鎂離子濃度為1—5 mmol/L時，光合細菌PB-Z在培養(yǎng)至36 h時得到最大產(chǎn)氫速率。但是當鎂離子濃度為7 mmol/L時，光合細菌PB-Z的最大產(chǎn)氫速率出現(xiàn)在第48小時。表明不同濃度的鎂離子對光合細菌PB-Z產(chǎn)氫速率隨時間變化的趨勢有著一定的影響。當鎂離子濃度為5 mmol/L時，得到最佳和最大產(chǎn)氫速率為(25.96+2.35) mL H2/(L．h)。光合細菌PB-Z具有良好的產(chǎn)氫性能，其產(chǎn)氫量與產(chǎn)氫速率均高于Siang Chen Wu等和Ela Eroglu等篩選的光合細菌Rhodopseudomonas palustris WP3-5和Rhodops -eudomonas sphaeroides O.U.OOl.

2.2  響應(yīng)面法(RSM)分析

2.2.1  響應(yīng)曲面設(shè)計實驗結(jié)果分析

 利用響應(yīng)面法考察各因素交互作用的影響，共17個實驗點，其中13個為析因點，4個為零點。零點實驗進行4次，做誤差：1，結(jié)果如表2所示。對實驗結(jié)果擬合，建立各個參數(shù)和相應(yīng)量的二次方程式如下：

 Y =605.76 -50.8A +24.18B +132.83C +6.72AB+29.88AC_3.07BC_122.52A2_207.22B2_88.67C2

對表2中的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，得到回歸方程式的方差分析如表3所示。

 由表3可知，模型P=O.OO0 4<0.001，說明實驗所采用的二次模型是極顯著的，在統(tǒng)計學上是有意義的；模型中的參數(shù)A、C、A2、B2、C2也是顯著的(P<0.05)。模型的適應(yīng)性顯著（F值為19.42，P<O.OOl），模型的失擬項不顯著(P=0.092 0>0.05)，說明回歸方程描述各因子與響應(yīng)值之間的非線性方程關(guān)系是顯著的，也就是說明這種實驗方法是可靠的。模型的相關(guān)系數(shù)是0.961 5，說明該模型能解釋96.15%響應(yīng)值的變化，即該模型與實際實驗擬合良好。修正復相關(guān)系數(shù)平方R2礎(chǔ)= 0.923 4，進一步說明模型具有較好的回歸性。精確度是反應(yīng)信號噪聲比的，通常要求大于4。本模型的精確度為11.409，說明模型是精確的，在設(shè)計區(qū)間內(nèi)是有效的。綜上所述，說明在研究區(qū)域內(nèi)該回歸方程能夠很好地模擬真實的曲面，模型的精密度、可信度和精確度均在可行的范圍內(nèi)，因此可用該回歸模型對光合細菌產(chǎn)氫過程中的產(chǎn)氫量優(yōu)化實驗條件進行分析、預(yù)測。

2.2.2  響應(yīng)曲面分析與優(yōu)化

  根據(jù)回歸方程，采用Design-Expert軟件對該模型繪制響應(yīng)曲面圖，考察所擬合的響應(yīng)曲面形狀，圖5—7所示為回歸方程預(yù)測的3個因素耦合影響下的響應(yīng)面三維圖及相應(yīng)等高線圖。

 圖5表明，鎂離子濃度和pH對光合細菌PB-Z產(chǎn)氫影響呈拋物線型關(guān)系，且均有一個極大值點。在當前實驗范圍內(nèi)，當鎂離子濃度不變，隨著pH的升高，產(chǎn)氫量先升高后降低，當pH不變，隨著鎂離子濃度的升高，產(chǎn)氫量先升高后降低。產(chǎn)氫量變化速率顯示．鎂離子濃度的主效應(yīng)強于pH效應(yīng)，等高線接近圓形，說明鎂離子濃度和pH的交互作用不顯著。圖6反映了鎂離子濃度與反應(yīng)時間對產(chǎn)氫量的交互影響，當反應(yīng)時間不變時，隨著鎂離子濃度的升高，產(chǎn)氫量先升高后降低。當鎂離子濃度不變時，隨著反應(yīng)時間的增長，產(chǎn)氫量變化曲線呈增長趨勢并逐漸趨于平緩，產(chǎn)氫量變化速率顯示，鎂離子濃度的主效應(yīng)弱于反應(yīng)時間效應(yīng)，等高線接近橢圓，說明鎂離子濃度與反應(yīng)時間交互作用顯著。由圖7看出，當反應(yīng)時間不變時，隨著pH的升高，產(chǎn)氫量先升高后降低。當pH不變時，隨著反應(yīng)時間的增長，產(chǎn)氫量變化曲線呈增長趨勢并逐漸趨于平緩，產(chǎn)氫量變化速率顯示，pH的主效應(yīng)弱于反應(yīng)時間效應(yīng)，等高線接近橢圓，說明pH與反應(yīng)時間交互作用顯著。

 3組圖直觀地反映了各個因素對響應(yīng)值的影響，利用Design-Expert軟件進行實驗結(jié)果優(yōu)化，本實驗主要目的在于優(yōu)化光合細菌PB-Z最適產(chǎn)氫條件，通過分析得到優(yōu)化結(jié)果為：鎂離子濃度4.77 mmoUL，初始pH 7.05，反應(yīng)時間77.5 h，此時光合細菌PB -Z的產(chǎn)氫量為657.7 ml/L-培養(yǎng)基。光合細菌產(chǎn)氫3個參數(shù)對產(chǎn)氫量的影響兩兩之間有一定的交互作用，其中初始pH值，反應(yīng)時間，鎂離子濃度對產(chǎn)氫量影響大小為：反應(yīng)時間>鎂離子濃度>初始pH值。

2.2.3  實驗結(jié)果驗證

 為檢測響應(yīng)曲面法所得結(jié)果的可靠性，再次進行實驗，采用上述優(yōu)化條件進行3次平行實驗，實際測得的平均產(chǎn)氫量為689.3 ml/L-培養(yǎng)基，實驗值與理論值相對誤差僅為4.8%，證明應(yīng)用響應(yīng)曲面優(yōu)化光合細菌PB-Z的產(chǎn)氫條件是可行的。

3  結(jié)論

 本文通過單因素試驗，研究影響光合細菌PB-Z的產(chǎn)氫條件的3個重要因素，即鎂離子濃度、pH、反應(yīng)時間。利用Design-Expert軟件對該模型繪制響應(yīng)曲面圖，建立優(yōu)化光合細菌PB-Z最適產(chǎn)氫條件的數(shù)學模型，根據(jù)回歸分析可知光合細菌PB-Z最適產(chǎn)氫條件是：鎂離子濃度4.77 mmol/L，初始pH 7.05，反應(yīng)時間77.5 h，其中初始pH值，反應(yīng)時間，鎂離子濃度對產(chǎn)氫量影響大小為：反應(yīng)時間>鎂離子濃度>初始pH值。為進一步研究提供了科學依據(jù)。