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響應(yīng)面優(yōu)化好氧反硝化菌的硝化影響因子

 李紫惠,  曹剛,  邵基倫,  黃鄭鄭,  莫測輝,

(1.暨南大學(xué)環(huán)境學(xué)院,廣東廣州.5106;30;

2.廣東省高校水土環(huán)境毒害性污染防治與生物修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東廣州510630)

 摘要:異養(yǎng)硝化一好氧反硝化菌是一種新型生物脫氮菌,篩選出脫氮效率高的菌株并對其硝化條件進(jìn)行優(yōu)化具有重要意義。從實(shí)驗(yàn)室篩選出的異養(yǎng)脫氮菌XH02出發(fā),通過生理生化及分子生物學(xué)方法對其鑒定,結(jié)果表明,高效脫氮菌株XH02與人蒼I 7I樸曲Ochrobactrumanthropi的ATCC 49188序列同源性最高,初步鑒定為人蒼白桿菌;利用響應(yīng)面法對溫度、轉(zhuǎn)速、碳氮比(C/N)和初始pH值4個(gè)異養(yǎng)硝化影響因子進(jìn)行優(yōu)化,得到在10%接種量下XH02菌最佳硝化條件,即溫度34℃,轉(zhuǎn)速125 r/min,C/N 7.5,初始pH 7.5;該條件下,在24 h時(shí)氨氮去除率可達(dá)82.4%。通過3次平行試驗(yàn)驗(yàn)證表明,在4個(gè)環(huán)境影響因子優(yōu)化后的條件下,該菌對氨氮的去除率為82.2%,與預(yù)測值相對誤差為0.3%,表明模型模擬效果良好。文章對具有異養(yǎng)硝化好氧反硝化功能的Ochrobactrum anthropi菌用于牛物脫氮的工程實(shí)踐提供參考。

 關(guān)鍵詞:異養(yǎng)硝化一好氧反硝化;  響應(yīng)面法;  人蒼白桿菌;影響因子;優(yōu)化

 隨著工業(yè)化和城市化進(jìn)程的加快,我國含氮廢水進(jìn)入水體引發(fā)的水質(zhì)惡化及富營養(yǎng)化問題日益嚴(yán)重,對人體健康和生態(tài)環(huán)境造成潛在的威脅。目前國內(nèi)外處理含氮廢水的方法主要有物理法、化學(xué)法和生物法。物理法和化學(xué)法成本高且工藝復(fù)雜,一般只能去除水中特定形態(tài)的氮且對環(huán)境有二次污染。生物法由于其具有成本低、操作簡單、無二次污染和處理效果好的特點(diǎn),目前廣泛應(yīng)用于水體脫氮的過程中。傳統(tǒng)生物脫氮技術(shù)中硝化和反硝化是2個(gè)相互獨(dú)立的過程,且整個(gè)生物脫氮過程不能同時(shí)在同一空間進(jìn)行,導(dǎo)致其脫氮工藝較長而且復(fù)雜。鑒于此,人們提出了一些新型生物脫氮技術(shù),如厭氧氨氧化、短程硝化反

硝化和同步硝化反硝化等。近年來,隨著越來越多的異養(yǎng)硝化菌和好氧反硝化菌的發(fā)現(xiàn)分離,傳統(tǒng)的生物脫氮技術(shù)正在被打破,研究表明,異養(yǎng)硝化菌可以將氨氮直接轉(zhuǎn)化為羥胺、亞硝酸鹽、硝酸鹽,好氧反硝化菌可以將亞硝酸鹽、硝酸鹽直接還原為氮?dú)夂脱趸瘉喌葰鈶B(tài)產(chǎn)物。目前,越來越多的研究表明,有些菌能在有氧條件下完成反硝化,而且有些菌可以進(jìn)行異養(yǎng)硝化一好氧反硝化。這也使得有關(guān)異養(yǎng)硝化一反硝化生物脫氮的研究逐漸成為熱點(diǎn)。異養(yǎng)硝化一好氧反硝化菌的研究目前主要集中在在假單胞菌屬(Pseudomonas)、芽孢桿菌屬(Bacillus)和產(chǎn)堿菌屬(Alcaligenes)等,而對人蒼白桿菌屬(Ochrobactrum anthropi)的研究則鮮有報(bào)道。

 目前人蒼白桿菌的研究主要集中在其致病性、感染性、還原重金屬能力等方面,而人蒼白桿菌作為具有異養(yǎng)硝化一好氧反硝化能力的菌株,在脫氮方面的研究較少,因此本文對人蒼白桿菌硝化條件的研究有一定的意義。

 目前許多異養(yǎng)硝化一好氧反硝化菌的研究主要集中在實(shí)驗(yàn)室階段,需要進(jìn)一步研究才能有效應(yīng)用于實(shí)際工程中,并且相關(guān)的機(jī)理研究還不夠深入,需進(jìn)一步研究。

 影響異養(yǎng)硝化一好氧反硝化菌生長的因素很多,主要包括碳源、氮源、接種量、溫度、pH值、C/N、溶解氧等,因此如何對其培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化顯得非常重要。目前對異養(yǎng)硝化一好氧反硝化菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化方法主要有單因素法和正交試驗(yàn)法,而應(yīng)用響應(yīng)面法對該類菌硝化條件的優(yōu)化較少。響應(yīng)面法是一種尋找多因子系統(tǒng)中最優(yōu)條件的數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)方法,可以較精確地研究各因子之間的關(guān)系,從而獲得最優(yōu)方案。該方法試驗(yàn)次數(shù)少、周期短,能夠研究幾個(gè)因素間交互作用,求得的因素與響應(yīng)值間的回歸方程精確度高。目前,響應(yīng)面法已應(yīng)用于生物、食品、農(nóng)業(yè)和化學(xué)等領(lǐng)域,如陳麗娟等采用響應(yīng)面法分析法對苯酚降解影響因素進(jìn)行優(yōu)化。

 本文從廣州大坦沙污水處理廠好氧段活性污泥中篩選出一株高效脫氮的異養(yǎng)硝化一好氧反硝化菌,對其進(jìn)行生理生化及16S rDNA鑒定,并利用響應(yīng)面法從溫度、初始pH值、C/N、轉(zhuǎn)速共4個(gè)環(huán)境因素方面優(yōu)化其硝化條件,使其達(dá)到最佳的脫氮效率,為異養(yǎng)硝化菌用于生物脫氮的工程實(shí)踐提供參考。

1試驗(yàn)材料和方法

1.1  實(shí)驗(yàn)菌株來源

 從廣州大坦沙污水處理廠好氧段活性污泥中篩選分離的異養(yǎng)硝化一好氧反硝化菌株,編號為XH02。

1.2培養(yǎng)基

 LB培養(yǎng)基:牛肉膏3g,蛋白胨10 g,氯化鈉5g,加水溶解,補(bǔ)充蒸餾水至1000 mL,pH 7.4—7.6。用于菌株活化。

 異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基:(NH4)。S0。lg,檸檬酸鈉520 g,Na2HP04 0.5 g,KH2P04 0.5 g,MgS04' 7H20 0.2 g,NaCl 30 g,微量元素2.00 mL,加水溶解,補(bǔ)充蒸餾水至1000 mL,pH 7.0—7.5。用于菌株篩選及硝化性能的測定。

 好氧反硝化培養(yǎng)基:KNO。lg,檸檬酸鈉5.52 g,Na2HP04 2.0 g,KHzP04 1.0 g,MgS04-7Hz0 0.1 g,微量元素2.00 mL,加水溶解,補(bǔ)充蒸餾水至1 000 mL,pH 7.0~7.3。用于菌株反硝化性能的測定。

 微量元素溶液:EDTA 50.0 g.ZnS04 2.2 g,CaCl2 55 g,MnCl2-4H20 5.06 g,FeSO t-7H20 5.0 g, (NH,1)C}Mo.02'4H20 1.1 g,CuSOd -5H20 1.57 g,CoCl2-6H20 1.61 g,加水溶解,補(bǔ)充蒸餾水至1 000 mL,pH 6.O。

 滅菌條件:所有培養(yǎng)基經(jīng)121℃,滅菌20 min。試驗(yàn)中根據(jù)不同C/N調(diào)節(jié)異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基中檸檬酸鈉的量使其符合試驗(yàn)要求。

1.3主要儀器設(shè)備

 THZ-C恒溫振蕩器,SW-CJ-1F型單人雙面凈化工作臺(蘇州凈化有限公司),LRH-250-A生化培養(yǎng)箱,LDZX-75KBS立式壓力蒸汽滅菌器,Labnet P3960移液槍(美國萊伯特公司),YP-B10002型電子天平(上海光正醫(yī)療儀器有限公司),PHS-25 pH計(jì),UVmini-1240紫外可見分光光度計(jì),PCR儀。

1.4  菌株的硝化及反硝化特性的測定

 將待測菌株分別按10%接種量加入到異養(yǎng)硝化和好氧反硝化培養(yǎng)基中,每隔12 h測定氨氮及硝態(tài)氮的去除率。

1.5分析方法

 試驗(yàn)中測試指標(biāo)和測定方法如下:氨氮,納氏試劑分光光度法;硝態(tài)氮,紫外分光光度法。

1.6菌株的鑒定

 參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》,得到通用引物27F和1492R,采用Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取待測菌模板DNA,對待測菌株基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增,送出測序。

1.7菌株硝化影響因子的優(yōu)化

 在以溫度、C/N、轉(zhuǎn)速和初始pH值為單一變量的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,采用響應(yīng)面法對硝化的影響因子進(jìn)行優(yōu)化。

2結(jié)果與討論

2.1  菌株的硝化及反硝化特性曲線

從圖1可以看出,在設(shè)定溫度為30℃、轉(zhuǎn)速為120 r/min、接種量為10%和初始pH值為7.0的條件下,該菌氨氮及硝態(tài)氮去除率均隨著培養(yǎng)時(shí)間的增大而增大。該菌株在24 h時(shí)氨氮及硝態(tài)氮去除率均在75%左右,繼續(xù)培養(yǎng)氨氮及硝態(tài)氮去除率繼續(xù)增大,在48 h時(shí)達(dá)到90%左右,表明該菌株的硝化及反硝化作用均較好。為了盡量控制可變因素,以后每次實(shí)驗(yàn)接種前菌株活化時(shí)間和培養(yǎng)時(shí)間均取24 h。

2.2菌株XH02的鑒定

2.2.1形態(tài)學(xué)鑒定

XH02菌的電鏡掃描結(jié)果見圖2,該菌呈細(xì)桿狀,大小為0.5 ymx1.0 p4m。

2.2.2分子生物學(xué)鑒定

 利用通用引物27F、1492R對菌株XH02的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果提交到NCBI,經(jīng)BLAST檢索、比對并用MEGA 5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)果見圖3。由圖3可知菌株XH02與人蒼白桿菌Ochrobactrum anthropi )ATCC  49188序列同源性最高,達(dá)到99%,結(jié)合菌株的形態(tài)學(xué)和生理生化特性,基

本確定菌株XH02屬于人蒼白桿菌(Ochrobactrumanthropi)。

2.3菌株XH02異養(yǎng)硝化的單個(gè)環(huán)境因子的最佳范圍確定

2.3.1最佳溫度的確定

溫度的大小會直接影響菌株相關(guān)酶的活性和對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收,適宜的溫度有利于菌株在環(huán)境中生存,有利于發(fā)揮菌株最佳的脫氮能力。一般而言,異養(yǎng)硝化一好氧反硝化菌的最適溫度在25—37℃范圍內(nèi)。本文選取溫度分別為20、25、30、35和40℃。由圖4可知,當(dāng)溫度較低時(shí),氨氮去除率隨溫度的增加而增加;當(dāng)溫度為35℃附近時(shí),氨氮去除率達(dá)到最大值;隨后,隨著溫度的增加,氨氮去除率降低。因此,在其他條件不變的條件下,確定其最佳溫度在35℃附近。

 可見中溫環(huán)境下該菌脫氮效果較好,溫度較高或較低可能會影響菌株中酶的活性從而導(dǎo)致脫氮效率降低,這與姜明嬌研究的高效異養(yǎng)硝化菌B9的最適溫度35℃一致。

2.3.2最佳轉(zhuǎn)速的確定

溶解氧的多少對于好氧型細(xì)菌的生存至關(guān)重要,不同的好氧型細(xì)菌因其代謝機(jī)制不同,對溶解氧的需求也不盡相同,而搖床轉(zhuǎn)速的變化會影響培養(yǎng)基中溶解氧含量的多少,因此可通過搖床轉(zhuǎn)速的改變來改變培養(yǎng)基中的溶解氧濃度。由圖5可知,轉(zhuǎn)速較低時(shí)氨氮去除率隨轉(zhuǎn)速的增加而增加;當(dāng)轉(zhuǎn)速為120 r/min附近時(shí),氨氮去除率達(dá)到最大;之后,隨著轉(zhuǎn)速的增加,氨氮去除率降低。因此,確定其最佳轉(zhuǎn)速在120 r/min左右。

  可見異養(yǎng)硝化一好氧反硝化菌對溶解氧的需求是有限的,該菌對溶解氧的需求不宜太高。這與邵基倫研究的異養(yǎng)硝化一好氧反硝化Burkhloderia sp.YX02菌的最適宜轉(zhuǎn)速為120 r/min 一致。

2.3.3最佳C/N的確定

  C/N對異養(yǎng)硝化菌的脫氮率有顯著影響,一般而言,異養(yǎng)硝化菌能夠處理污水的C/N范圍為2~10。由圖6可知,氨氮去除率先隨著C/N的增加而增加;當(dāng)C/N在8.0附近時(shí),氨氮去除率達(dá)到最大值;之后,隨著C/N的增加,氨氮去除率降低。因此,確定其最佳C/N在8.0左右。

 CfN體現(xiàn)培養(yǎng)基中碳氮含量的關(guān)系,本試驗(yàn)菌株的最佳C/N在8左右,處于正常范圍,這與袁夢冬等研究的異養(yǎng)硝化一好氧反硝化菌的最佳C/N為8的結(jié)果一致。

2.3.4最佳初始pH值的確定

pH影響生長代謝過程中各種酶的活性和培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的離子化程度和有害物質(zhì)的毒性,因此,初始pH值是影響微生物活性的重要因素。而大多數(shù)異養(yǎng)硝化一好氧反硝化菌的最適宜pH在6—9范圍內(nèi)。由圖7可知,初始pH值較低時(shí),氨氮去除率隨初始pH值的增大而增加,當(dāng)初始pH值在7.0附近時(shí),氨氮去除率達(dá)到最大值,隨后,隨著初始pH值的增大氨氮去除率下降。因此,確定其最佳初始pH值在7.0左右。

 大多數(shù)細(xì)菌在pH為中性時(shí)生長速度最快,本試驗(yàn)菌株的最佳pH在7左右時(shí)脫氮效率較高,pH處于正常范圍內(nèi),這與邵基倫研究的異養(yǎng)硝化菌的最適pH為7.0的結(jié)果一致。

2.4響應(yīng)面法優(yōu)化XH02菌的異養(yǎng)硝化影響因子

2.4.1  Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)初期試驗(yàn)結(jié)果,確定溫度、轉(zhuǎn)速、C/N和初始pH值的q1心點(diǎn)分別為35℃、120 r/min、8.0和7.0。表1是響應(yīng)面優(yōu)化XH02的硝化影響因子及水平,采用Design-Expert.V8軟件對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行4次回歸方程預(yù)測及方差分析,結(jié)果見表2。

2.4.2  四次回歸擬合及方差分析

 以第24小時(shí)時(shí)的氨氮去除率為響應(yīng)值,采用Design Expert.V8軟件對表2數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析,得到回歸方程式:氨氮去除率=81.89-2.10A+1.41B -1.35C +1.47D -1.60AB +1.47AC -1.88AD +1.51BC+1.89BD _12.34A2 _7.4082 _4.41C2 _3.89D2 +3.46A2B+2.22A2D _1.11AC2+0.7382C +3.75A282。式中:A為溫度;B為轉(zhuǎn)速;C為C/N比;D為初始pH值。

 對所得模型進(jìn)行方差分析可知(表2),模型P<0.000 1,說明四次回歸方程極顯著;失擬項(xiàng)P為0.135 3>0.05,差異不顯著,不必引入更高次項(xiàng),模型選擇正確;模型R2-0.997 1,說明四次回歸模型能較好地反映響應(yīng)值的變化,模型預(yù)測值和響應(yīng)值之間有很高的相關(guān)性。

 溫度、轉(zhuǎn)速、C/N、初始pH值的一次和二次項(xiàng)即溫度和轉(zhuǎn)速、溫度和C/N、溫度和初始pH值、轉(zhuǎn)速和C/N、轉(zhuǎn)速和初始pH值之間的交互作用對氨氮去除率的影響達(dá)到極顯著水平(P<0.01)。由于C/N和初始pH值之間即CD項(xiàng)對模型影響不顯著,因此模型中不包含CD項(xiàng)。

2.4.3響應(yīng)面分析及最佳異養(yǎng)硝化條件確定

根據(jù)該回歸方程作響應(yīng)面圖,分析轉(zhuǎn)速、溫度、C/N和初始pH值對XH02菌去除氨氮的影響,圖8顯示了4個(gè)影響因子相互之間的響應(yīng)面,每個(gè)響應(yīng)面圖分別代表2個(gè)獨(dú)立變量之間的相互作用,而此時(shí)另外2個(gè)變量保持在中心點(diǎn)水平不變。由圖8可知,5個(gè)響應(yīng)面均為開口向下的凸形曲面,從其倒映的等高線圖可以直觀地看出兩因素之間的交互作用,等高線的形狀反映出交互作用的強(qiáng)弱,圓形表示兩因素交互作用不顯著,等高線形狀越接近橢圓則表示兩因素間交互作用越強(qiáng)。圖8中的(a)、(d)、(e)的等高線呈圓形,而圖8(b)、(c)值的等高線呈近似圓形,這表明,溫度和轉(zhuǎn)速、轉(zhuǎn)速和C/N、轉(zhuǎn)速和初始pH值、溫度和C/N及溫度和初始pH值之間基本上無交互作用。從圖中還可直觀地看出溫度、轉(zhuǎn)速、C/N和初始pH的最佳值分別在32—36℃、120~126 r/min、7.5—8.0和7.0—7.5范圍內(nèi)。

 從圖8中可知,回歸方程存在穩(wěn)定點(diǎn),即存在極大值點(diǎn)使得響應(yīng)值取得最大值,由回歸方程可得到最佳異養(yǎng)硝化條件:溫度34.32℃、轉(zhuǎn)速123.93 r/min、C/N為7.69和初始pH值7.26,此時(shí)蒼白桿菌的硝化效率最高,達(dá)到82.4%。考慮到實(shí)際操作的便利,將最佳的硝化條件修正為溫度34℃、轉(zhuǎn)速125 r/min、C/N7.5和初始pH值7.5。

2.5驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

  在以上確定的最優(yōu)條件下,進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn),所得氨氮去除率分別為81.8%、82.3%、82.5%,平均氨氮去除率為82.2%。實(shí)測值與模型預(yù)測值相對誤差為0.3%,說明模型模擬效果良好。

  響應(yīng)面法在實(shí)驗(yàn)條件尋優(yōu)過程中,可以連續(xù)的對實(shí)驗(yàn)的各個(gè)水平進(jìn)行分析,且能研究幾種因素間的交互作用。與驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較,采用響應(yīng)面優(yōu)化的得到的XH02菌的異養(yǎng)硝化條件準(zhǔn)確可靠,具有實(shí)用價(jià)值。

3結(jié)論

  本文從好氧段活性污泥中篩選出一株高效異養(yǎng)硝化一好氧反硝化菌株,經(jīng)鑒定確定為人蒼白桿菌屬。

  本文通過響應(yīng)面法對Ochrobactrum anthropi菌的溫度、轉(zhuǎn)速、C/N和初始pH值共4個(gè)硝化影響因子進(jìn)行優(yōu)化,得到在10%接種量下Ochrobactrum anthropi菌最佳硝化條件,即溫度34℃,轉(zhuǎn)速l25 r/min,C/N7.5,初始pH 7.5;該條件下,Ochrobactrum anthropi菌在24 h時(shí)對氨氮的實(shí)際去除率為82.2%,與預(yù)測值相對誤差為0.3%。響應(yīng)面法對于優(yōu)化異養(yǎng)硝化一好氧反硝化菌的脫氮條件具有良好的效果。

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