黃精提取物不同極性組分的體外抗氧化活性研究
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楊陽1，巫水華1*，陳安徽1，劉恩岐1，單秋麗2，李繼武3
1．徐州工程學(xué)院，江蘇省食品資源開發(fā)與質(zhì)量安全重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室（徐州221111）；
2．濟(jì)南大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院（濟(jì)南250002）；3．亳州千草藥業(yè)有限公司（亳州236000）
摘要對黃精提取物不同極性組分的體外抗氧化活性進(jìn)行研究。以70%乙醇為溶劑，利用閃式提取器對黃精進(jìn)行提取，并依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇對黃精醇提物進(jìn)行分級萃取，采用測定總還原力的大小和DPPH．、．OH、O2-·及ABTS+．清除率等指標(biāo)來評價黃精不同極性組分的抗氧化能力。結(jié)果表明，黃精不同極性組分均有較強(qiáng)的總還原力和清除自由基的能力，并呈明顯的量效關(guān)系。其中水相的總還原力最高且對.OH清除效果最好，乙酸乙酯相清除DPPH．和ABTS+．效果最好，正丁醇相清除O2-．效果最好。試驗(yàn)結(jié)果提示黃精各個極性組分均具有一定的抗氧化效果，是天然抗氧化劑的良好來源。
關(guān)鍵詞黃精；提取物；體外；抗氧化
生物體在新陳代謝過程中會產(chǎn)生一些自由基，在正常情況下它們處于低水平的平衡狀態(tài)，具有一定的作用，但在病理情況下活性氧代謝過剩時，自由基由于其氧化能力強(qiáng)、反應(yīng)活性高，給人體健康帶來很大的危害。大量研究表明，自由基與心血管疾病、糖尿病和癌癥等疾病存在聯(lián)系。隨著年紀(jì)增長、環(huán)境惡化等因素的影響，人體清除自由基的能力下降，導(dǎo)致自由基在人體內(nèi)堆積，人體免疫力下降進(jìn)而引發(fā)一系列疾病。因此，尋求一種能清除自由基的天然抗氧化劑具有重要研究意義。
黃精（Polygonatum sibiricum Redoute）為百合科草本類植物，是我國一種傳統(tǒng)的中藥，其藥用歷史已有2 000多年，其具有寬中益氣、益腎填精、滋陰潤肺以及生津補(bǔ)脾等功效，多用于咳嗽、免疫力低下以及肺部疾病的治療。當(dāng)代藥理學(xué)研究表明，黃精中的主要活性成分有多糖、黃酮類物質(zhì)、皂苷類物質(zhì)、生物堿、木質(zhì)素和氨基酸等，這些活性成分具有抗氧化、延緩衰老、降低血糖、降低血脂、調(diào)節(jié)免疫力、強(qiáng)心、抗炎、提高和改善記憶力等生理功能。目前，國內(nèi)外對黃精多糖和皂苷的研究報道較多，而對于其他成分的研究鮮有報道。
用極性不同溶劑對黃精醇提物進(jìn)行分級萃取，得到不同極性萃取相，通過測定各個組分的總還原力大小和DPPH．、．OH、O2-·及ABTS+．清除率等指標(biāo)，綜合評價黃精提取物不同極性組分的體外抗氧化能力，為進(jìn)一步開發(fā)利用黃精資源提供科學(xué)依據(jù)。
1 材料與方法
1.1材料與試劑
黃精：亳州千草藥業(yè)有限公司；DPPH:美國Sigma公司；ABTS：Amresco公司；其余試劑均為分析純。
1.2儀器與設(shè)備
ZHBE-50T閃式提取器：河南智晶生物科技發(fā)展有限公司；R206旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海申生科技有限公司：723C可見分光光度計(jì)：上海欣茂儀器有限公司；TU-1810紫外分光光度計(jì)：北京普析通用有限公司；TDL-80-2B離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠。
1.3方法
1.3.1黃精提取物的制備
黃精經(jīng)粉碎后，過100目篩，稱取一定量的黃精粉，按料液比為1：25(g/m L)加入70%乙醇，利用閃式提取器（電壓100 V，檔速4），提取3次，每次1 min,過濾，濾液于50 ℃下減壓濃縮，回收乙醇，得到深褐色漿狀物，即為黃精提取物。
1.3.2不同極性組分的分離
取一定量的黃精提取物，溶于純水中，充分震蕩分散后，移入分液漏斗中，加入200 m L石油醚，震蕩搖勻，靜置分層后保留上層石油醚相，下層水相使用同樣的方法萃取2次，合并3次石油醚萃取液，于45℃下減壓濃縮，回收石油醚，得到黃精提取物的石油醚相。石油醚萃取后的剩余水溶液按照上述方法用乙酸乙酯萃取3次，合并3次乙酸乙酯萃取液，于50℃下減壓濃縮，回收乙酸乙酯，得到黃精提取物的乙酸乙酯相。乙酸乙酯萃取后的剩余水溶液按上述方法用正丁醇萃取3次，合并3次正丁醇萃取液，于70℃下減壓濃縮，回收正丁醇，得到黃精提取物的正丁醇相。正丁醇萃取后的水溶液于60℃下減壓濃縮，得到黃精提取物的水相。
1.3.3不同極性樣品溶液的制備
準(zhǔn)確稱取黃精提取物的石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相4個部分樣品，溶于70%乙醇溶液中，避光低溫保存?zhèn)溆谩?
1.3.4還原力的測定
參照吳峰華等的方法，并作適當(dāng)?shù)男薷摹Ｈ〔煌瑵舛鹊母鳂悠啡芤?.0 m L，分別加入0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液( pH 6.6) 2.5 m L和1%的鐵氰化鉀溶液2.5 m L，混勻，50℃水浴中保溫20 min，然后加入2.5 m L 10%的三氯乙酸溶液，混勻后于3 000 r/min離心10 min，取上清液2.5 m L，再加入2.5 m L蒸餾水和0.5 m L 0.1%的三氯化鐵溶液，于700 nm處測定吸光度，吸光度越大表示還原力越大。
1.3.5 DPPH．清除率的測定
參照Brahmi等的方法，并作適當(dāng)改動。取不同濃度的各樣品溶液1 m L于試管中，分別加入3 m L 0.04mg/m L的DPPH溶液（無水乙醇配制），于室溫下避光反應(yīng)30 min后，用無水乙醇作空白，在517 nm下測定吸光度A1，同時用蒸餾水代替樣品溶液測得吸光度A0，1 m L樣品溶液與3 m L乙醇溶液的吸光度A2，清除率按照式(1)計(jì)算。
1.3.6ABTS+．清除率的測定
參照高忠梅等的方法，并做適當(dāng)改進(jìn)。
ABTS+．工作液的制備：精密移取7 m mol/L的ABTS溶液2.5 m L與7.35 m mol/L的過硫酸鉀溶液2.5 m L混合后，在室溫下黑暗處放置12 h，用無水乙醇稀釋40～50倍，于734 nm處測定吸光度，為0.70±0.02，即得ABTS+．工作液。
測定步驟：取不同濃度的各樣品溶液0.2 m L置于比色皿中，分別加入1 m L ABTS+．工作液，混合后，避光放置反應(yīng)6 min后，用無水乙醇作空白，于734nm處測定吸光度A，以無水乙醇代替樣液測得吸光度A0，清除率按式(2)計(jì)算。
1.3.7 ·OH清除率的測定
參照張海暉等的方法，并做適當(dāng)改進(jìn)。取不同濃度各樣品溶液1mL于試管中，分別加入1 m L 9m mol/L的FeSO4溶液和1 m L 9 m mol/L的水楊酸一乙醇溶液，最后加入1 m L 8.8 m mol/L的H2O2溶液啟動反應(yīng)。用蒸餾水作空白，在510 nm處測定吸光度A1，同時用蒸餾水代替樣品溶液測得吸光度A0，不加顯色劑H2O2溶液的吸光度A2，清除率按照式(3)計(jì)算。
1.3.8 O2-·清除率的測定
采用鄰苯三酚自氧化法，參照賈長虹等的方法，并做適當(dāng)改動。取2 m L待測樣品溶液置于試管中，加入50 m mol/L pH 8.2的Tris- HCl溶液5 m L，置于25℃水浴中保溫10 min，然后加入0.1 m L 25 0C預(yù)熱好的6 m mol/L的鄰苯三酚溶液，迅速搖勻后，于320 nm下每隔30 s測定吸光度，直到反應(yīng)6 min為止，計(jì)算線性范圍內(nèi)每分鐘吸光度的變化△A，以蒸餾水代替樣品溶液測定吸光度變化△A0，清除率式(4)計(jì)算。
1.4半數(shù)抑制率(IC50)的計(jì)算
以樣品的濃度對吸光度或自由基清除率作圖并進(jìn)行線性擬合，計(jì)算IC50。IC50定義為吸光度為0.5或清除率為50%時樣品的濃度。
1.5數(shù)據(jù)處理
所有試驗(yàn)均重復(fù)3次以上，并采用SPSS 19.0軟件對進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，以p<0.05判斷為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；使用EXCEL軟件繪制曲線。
2結(jié)果與分析
2.1 黃精不同極性組分提取物的總還原力
總還原能力是評價提取物抗氧化能力的重要參考，試驗(yàn)以普魯士藍(lán)的生成量作為指標(biāo)，當(dāng)體系中存在抗氧化劑時會將六氰合鐵酸鉀還原成亞鐵氰化鉀，然后利用Fe3+形成Fe4[Fe(CN)6]3，在700 nm處測定吸光度的變化大小來檢測還原力大小。由圖1可知，黃精不同極性組分的提取物均有不同程度的還原力，且都有明顯的量效關(guān)系，即濃度越大，還原力越強(qiáng)。由表1可知，各極性組分的總還原力由大到小依次為：水相>正丁醇相>石油醚相>乙酸乙酯相。水相的IC50顯著小于正丁醇相、石油醚相和乙酸乙酯相(p<0.05)，乙酸乙酯相和石油醚相的IC50之間無顯著性差異(p>0.05)，說明乙酸乙酯相和石油醚相還原力相差不大。這表明黃精提取物各組分都能提供一定的氫原子，表現(xiàn)出較強(qiáng)的總還原能力。
2.2黃精不同極性組分對DPPH．的清除能力
DPPH．是非生理性自由基，它以氮為中心的穩(wěn)定的自由基，當(dāng)溶液中的抗氧化劑提供氫原子時，DPPH．中的孤對電子被配對而使得溶液顏色變淺，在517 nm處吸光度變小。由圖2可知，黃精的不同極性組分提取物均有較強(qiáng)的清除DPPH．的能力，并且存在著明顯的量效關(guān)系，即濃度越大，清除效果越好。由表1可知，清除DPPH．的能力由大到小依次為：乙酸乙酯相>正丁醇相>水相>石油醚相。其中乙酸乙酯相IC50顯著小于正丁醇相、水相和石油醚相(p<0.05)，但與正丁醇相的IC50之間無顯著差異(p>0.05)，表明正丁醇相與乙酸乙酯相清除DPPH．的能力相當(dāng)，水相次之，石油醚相清除能力最弱。
2.3黃精不同極性組分對ABTS+．的清除能力
ABTS+．清除率是快速、有效測定天然產(chǎn)物抗氧化能力的方法。由圖3可以看出，黃精不同極性組分的提取物均具有不同程度的清除ABTS+．的能力，且清除效果呈顯著的量效關(guān)系，即濃度越大，清除ABTS+．效果越好。同時由表1可看出，清除ABTS+·的能力由大到小依次為：乙酸乙酯相>水相>正丁醇相>石油醚相。乙酸乙酯相IC50顯著小于水相、正丁醇相和石油醚相(p<0.05)，同時正丁醇相和水相的IC50之間無顯著差異(p>0.05)，表明正丁醇相
與水相清除ABTS+．的能力相當(dāng)。
2.4黃精不同極性組分對．OH的清除能力
天然活性物質(zhì)清除．OH的能力直接與其抗氧化能力相關(guān)。利用H2O2與Fe2+混合后通過Fenton反應(yīng)產(chǎn)生．OH，在體系中加入水楊酸來捕捉.OH產(chǎn)生有色物質(zhì)，當(dāng)溶液中存在抗氧化劑時，.OH被清除，從而有色物質(zhì)生成量減少，導(dǎo)致在517 nm處吸光度減小。由圖4可以看出，黃精不同極性組分的提取物均具有不同程度的清除．OH的能力，且清除效果呈顯著的量效關(guān)系。由表1也可看出，清除．OH的能力由大到小依次為：水相>乙酸乙酯相>正丁醇相>石油醚相。其中石油醚相的IC50約為水相的IC50的30倍，同時水相的IC50顯著小于正丁醇相、石油醚相和乙酸乙酯相(p<0.05)。
2.5黃精不同極性組分對O2-·的清除能力
鄰苯三酚在弱堿的條件下會發(fā)生自氧化產(chǎn)生O2-．，在325 nm處有最大吸收。當(dāng)溶液中存在抗氧化劑時，O2-·被清除，在517 nm處吸光度減小。由圖5可以看出，黃精不同極性組分的提取物均具有不同程度的清除O2-·的能力，且清除效果呈顯著的量效依賴關(guān)系。由表1可看出，清除O2-·的能力由大到小依次為：正丁醇相>乙酸乙酯相>石油醚相>水相。正丁醇相的IC50顯著小于乙酸乙酯相、石油醚相和水相(p<0.05)，同時乙酸乙酯相和石油醚相的lC50之間無顯著性差異(p>0.05)，說明乙酸乙酯相和石油醚相對O2-·的清除能力相當(dāng)，這與總還原力結(jié)果一致。
3結(jié)論與討論
試驗(yàn)結(jié)果表明，黃精不同極性組分均具有抗氧化活性，且總還原力和清除自由基的效果均呈現(xiàn)有顯著的量效關(guān)系，同時各個組分的還原力和清除自由基能力等指標(biāo)存在差異，其中水相的總還原力和清除．OH的能力最高，IC50分別為0.543±0.018 mg/m L
和0.056±0.020 mg/m L;乙酸乙酯相清除DPPH．和ABTS+．效果最好，IC50分別為0.050±0.001 mg/m L和0.052±0.002 mg/m L，正丁醇相清除O2-·效果最好，IC50為0.047±0.013 mg/m L;乙酸乙酯相和石油醚相總還原力和清除O2-．的能力相當(dāng)，正丁醇相清除DPPH．能力與乙酸乙酯相相當(dāng)，水相清除ABTS+.能力與乙酸乙酯相當(dāng)。還原能力和清除自由基能力的差異可能與黃精不同極性組分中的活性物質(zhì)種類（多糖類和類黃酮物質(zhì)）和結(jié)構(gòu)的不同有關(guān)，分部進(jìn)行不同極性的活性物質(zhì)溶解在不同的極性溶劑中，從而導(dǎo)致不同組分清除自由基能力存在差異。另外，黃精不同極性組分的抗氧化作用對不同類型的自由基也表現(xiàn)出選擇性作用，其相關(guān)機(jī)理有待進(jìn)一步研究。
總體來看，乙酸乙酯相、正丁醇相和水相的抗氧化作用好，因此，可對其活性物質(zhì)進(jìn)一步分離，以確定黃精抗氧化作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。
