嗜冷型產碳酸酐酶菌對碳酸鈣沉積的影響
張文靜， 李瓊芳， 張存凱， 張偉， 楊麗君
（1．西南科技大學生命科學與-程學院，四川綿陽621010；
2．西南科技大學分析測試中心，四川綿陽621010；
3．西南科技大學同體廢物處理與資源化教育部重點實驗室，四川綿陽621010）
摘要：為探究四川黃龍鈣華地貌高寒水體中低溫微生物對碳酸鈣沉積的影響，該試驗自黃龍鈣華水體中分離到2株具有高產碳酸酐酶(CA)活力的嗜冷型菌株，在不同的初始pH值和不同的低溫沉積溫度下，通過測定沉積體系pH值和電導率的變化來研究菌株對碳酸鈣沉積過程的影響，并用X射線衍射儀( XRD)、紅外光譜儀(FT-IR)和掃描電子顯微鏡(SEM)對生成的碳酸鈣晶體進行晶型晶貌分析。結果表明：供試菌株在不同條件下都能促進碳酸鈣沉積，形成的晶體均為方解石型，但其形貌卻不盡相同尤其在初始pH值8.0，10℃低溫下對碳酸鈣沉積的影響最為顯著。研究結果表明供試嗜冷型碳酸酐酶產生菌株能在一定程度上調控碳酸鈣的沉積速率與晶體形貌結構，其結果可為探究低溫下黃龍鈣華的生物沉積機制提供一定的理論基礎。
關鍵詞：嗜冷型碳酸酐酶產生菌；低溫；碳酸鈣沉積；晶型晶貌
碳酸鹽是一種自然界普遍存在的高活性組分，是一種廣泛存在的生物礦物。生物礦化沉積碳酸鹽的現(xiàn)象在自然界是普遍存在的，其中又以生物礦化碳酸鈣( CaC03)為主。而碳酸鈣的沉積在自然界中極為緩慢，可以利用生物酶一碳酸酐酶(CA)來催化C02的可逆水合反應：C02+H20+CaC03'—+Ca2++2HC0:3~21。近年來已有研究微生物CA誘導的礦化作用對碳酸鈣形成的影響的相關報道。而CaC0;3沉積研究所使用的微生物種類很多，大部分是從淡水、海洋、土壤和高鹽度的環(huán)境中篩選出來的。已報道的能沉積碳酸鹽的微生物有嗜堿和嗜鹽微生物、尿素分解細菌、芽孢桿菌、硫酸鹽還原細菌、黏細菌、藍細菌等。
黃龍鈣華景觀作為著名的世界自然遺產，目前認為鈣華主要由物理及水化學作用產生的，而生物因素在鈣華形成過程中也起到了一定的作用。在生物成因中，由于藻類龐大的數(shù)量及其獨特的代謝方式，其對碳酸鈣沉積的影響已有學者做出相應的研究。而前期研究發(fā)現(xiàn)，黃龍水體中的細菌數(shù)量也極為可觀，僅可培養(yǎng)細菌就達到l.Oxl06 cfu/mL，而這些細菌必然會或多或少地參與到鈣華的沉積過程中。近年來，利用微生物對生物礦化碳酸鈣沉積的研究已日益得到人們的關注。例如，Baskar等研究表明嗜堿土壤微生物巴氏芽孢桿菌（Bacillus pasteurii）在沙土中誘導方解石沉積；分離于微生物巖( Microbialite)中的藍細菌在堿性條件下能夠在細胞內部合成無定形碳酸鹽補充了微生物誘導礦物形成的途徑。然而，對存在于水體中的大量嗜冷微生物（如嗜冷型碳酸酐酶產生菌），其生命活動在鈣華沉積過程中的參與程度鮮有報道。本試驗以分離自黃龍高寒鈣華水體中的嗜冷型產碳酸酐酶細菌作為研究對象，探索在不同條件下供試菌株對CaC0.3沉積的影響作用，為黃龍鈣華的生物成因及對提出防止鈣華退化的保護治理措施具有重要意義，并為深入研究低溫下微生物CA催化CaC03的沉積作用奠定一定的理論基礎。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1菌株及其培養(yǎng)基
選取本實驗室從黃龍鈣華沉積區(qū)水體中篩選得到的兩株嗜冷型高產碳酸酐酶細菌做為供試菌株，菌株編號為15-33和18-10，菌株編號是依據黃龍風景區(qū)鈣化池的編號而定的，15和18分別為五彩池和金沙鋪地的編號；33和10分別為所屬鈣化池里篩選菌株的編號。該菌株經前期大量試驗探究得出在10℃、pH 8.0條件下產碳酸酐酶活力最高。菌株的培養(yǎng)和活化均采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。水體鈣化池的性質如表1所示。
1.1.2主要試劑及儀器
主要試劑CaCI2、Na2C03均為分析純。主要儀器：美國ThermoFisher賽多利斯BSA124S型分析天平、BANTE PHS-3CW臺式數(shù)顯pH計、DDS-307+電導率儀、荷蘭飛利浦X- Pert PRO型X射線衍射儀(XRD)、Nicolet-5700(傅里葉變換)紅外光譜(FI'-IR)和LeicaCambridge LTD S440型掃描電子顯微鏡(SEM)。
1.2實驗方法
將菌株15 -33和18 -10活化后的菌液分別按2%的比例接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，在150 r/min、10℃下培養(yǎng)48 h，與50 mmol/L CaCI2和50 mmol/L Na2C03溶液，按體積比為1:1:1的體系設置，將體系的初始pH分別調為6.0、7.0、8.0、9.0，在10℃下進行沉積試驗。待確定最適pH后，以其作為最佳起始pH條件，再將體系分別置于溫度為5、10、15、20℃下進行沉積試驗。實驗持續(xù)72 h，以上每個處理重復3次。在試驗的第0小時開始取樣，12 h前每2h取一次樣，12 h后每12 h取一次樣，檢測pH值和電導率的變化。試驗結束后收集沉淀，沉淀用超純水洗滌、過濾，待自然干燥后分析所得沉淀的晶型晶貌。
2結果與分析
2.1不同條件下沉積過程中pH的變化
不同的初始pH條件下：pH對碳酸鈣沉積有著很大的影響，試驗菌株產生的CA催化C02的可逆水合反應，反應式如下：C02+H20+CaC03<—r+Ca2++2HC03一，生成的H+會影響CaC03的電離平衡，從而影響體系中碳酸鈣的沉積與溶解，進而改變體系的pH值。對不同初始pH值下碳酸鈣沉積過程中體系pH的變化進行分析，pH變化關系圖如圖1(a)~(b)中所示。2組試驗組和對照組的pH變化趨勢幾乎一致。不同之處在于，對照組的pH從初始9.0幾乎一直在下降，直到80 h仍表現(xiàn)為下降，而試驗組的pH 9.0在34 h前在下降，34 h后就幾乎保持穩(wěn)定。試驗組pH 6.0、7.0和8.0組都在22 h前表現(xiàn)出不同幅度的向上增長趨勢，在22 h后就幾乎平穩(wěn)，最后穩(wěn)定在7.94～8.2之間；而對照組在22～34 h仍在增長，到34 h后最終穩(wěn)定在7,85—8.26之間；可見，試驗組的pH比對照組的pH穩(wěn)定的時間提前了12 h，說明菌液里的CA促進了C02的溶解，促進了CaCO。的電離平衡。對該pH變化原因的分析可能是，在低pH值(6.0、7.0、8.0)條件下，pH值上升是由于反應剛開始C02的大量溶解以及Ca2+不斷轉變?yōu)镃aC03而溶液中加的C032-就與生成的H+結合，使得溶液中的OH-析出，pH增高，隨著溶液中Ca2+的消耗，pH達到動態(tài)平衡。而初始pH 9.0的實驗組中，pH的降低，可能是因為初始pH較高，更有利于C02的溶解，從而促使CaC03的生成，細菌代謝產生了酸性物質，使得溶液pH降低，而隨反應的不斷進行，溶液中沉積反應穩(wěn)定后pH也逐漸趨于穩(wěn)定。
不同的沉積溫度下：兩組試驗組的pH變化幾乎一致，與對照組類似。碳酸鈣沉積體系pH在0—2 h中急劇上升，在2h后pH都趨回7.7—8.2之間。在5℃和20℃體系的pH值比10℃和15℃的波動更大，而10℃下pH的變化更平穩(wěn)些。且實驗組的變化比對照組更顯著些，可能是因為試驗組中所添加入細菌的碳酸酐酶活性在10℃時最高，因此此時在實驗菌株產生的碳酸酐酶作用下，對pH值產生了一定的影響作用(如圖1(c)~(d))。
由圖1還可以看出，在不同處理條件下，pH值都趨于8.0左右，且在圖1(a)~(b)中，初始pH為8.0的pH值一直處于8.0左右，幾乎能維持平衡，說明在碳酸鈣的沉積過程中，pH 8.0對沉積影響不大，且更有利于沉積進行。
2.2不同條件下沉積過程中電導率的變化
電導率參數(shù)表征了溶液中游離態(tài)離子的總濃度。試驗前后溶液電導率的降低反映了溶液體系中導電離子結合成不導電物質的一個過程。實驗中電導率的變化主要是Ca2+與C032-離子結合形成CaC03晶體沉積，導致溶液中離子濃度的減少，導電能力的降低。在不同初始pH值條件下，電導率的變化趨勢大致相似，都表現(xiàn)為降一升一降三段式曲線，如圖2(a)所示。0—6 h電導率急速下降，6—48 h電導率又緩慢上升，48 h后又下降，后趨于穩(wěn)定。原因可能是剛開始游離的C032-和Ca2+都比較多，較快的發(fā)生了化學沉積；隨著反應的進行，體系中的碳酸酐酶促進了C02的溶解、細菌酸性代謝產物的產生、體系pH的降低(如圖1中22—48 h)，導致生成的CaC03沉積又發(fā)生了溶解，但最高點處的電導率仍小于沉淀初始的電導率，表明第1次的電導率下降主要是化學行為，第2次下降主要是生物行為，且由于細菌及其代謝產物的成核及聚集作用，導致第2次沉積更徹底，因而最后的電導率低于第1次沉積的電導率。
在不同溫度條件下，電導率的變化類似，關系如圖2(b)所示。0—2 h電導率急劇下降，2—48 h電導率相對穩(wěn)定，48 h后電導率又急劇下降至穩(wěn)定�？赡苁怯捎诓煌瑴囟认碌膒H是恒定的，比較穩(wěn)定，有利于維持離子濃度的穩(wěn)定。還可以看出，在相同時間段內試驗組的電導率大于對照組，說明細菌菌體的加入活躍了沉積體系，導致電導率上升，分析原因可能是細菌代謝將培養(yǎng)基中的有機質轉變?yōu)樗嵝晕镔|，從而溶解了部分碳酸鈣晶體。整個試驗在72 h時電導率最小，即體系離子濃度已經趨于最低，穩(wěn)定的生成了CaC03晶體。
2.3不同條件下得到的碳酸鈣晶體晶型晶貌
2.3.1 碳酸鈣的XRD圖譜
不同條件下得到的晶體用XRD檢測得到的圖譜都在20=23.10、29.50、36.10、39.50、43.20、47.60和48.6。等位置附近出現(xiàn)了特征衍射峰，對照標準卡片可知其產生的碳酸鈣沉淀晶型為方解石，其晶面基本相同，有(012)、(104)、(110)、(113)、(202)、(018)和(116)等晶面，其中優(yōu)勢晶面為( 104)（如圖3所示）。XRD圖譜分析結果表明，在不同的初始pH值和不同的溫度條件下，對生成的碳酸鈣晶體的晶型影響不大。
2.3.2碳酸鈣的FT-IR圖譜
不同條件下生成的碳酸鈣晶體用FI'-IR檢測得到的圖譜均在波數(shù)為1420、875、712 cm-1處出現(xiàn)了明顯的峰，（如圖4所示），這些峰均為方解石的特征峰，這與XRD圖譜結果一致。由圖4還可以看出，實驗組特征峰較對照組發(fā)生了藍移，如在圖4(a)中，由對照組的1418.43 cm-1分別偏移到了1 419.21和1 420.84 cm-1。藍移可能是由于有機質提供了碳酸鈣的成核位點，也可能是由于供試菌株的細胞本身或分泌物在沉積過程中起了聚集及成核作用。
2.3.3碳酸鈣的SEM圖譜
不同條件下得到的碳酸鈣樣品的SEM圖譜中，樣品CaCO。顆粒直徑分布在1～10um之間，形貌、大小、堆積密度存在明顯差異。不同初始pH值下得到的樣品SEM圖中，對照組CaC03顆粒形貌呈無規(guī)則塊狀以及球狀，表面粗糙，實驗組CaC03顆粒形貌呈菱形、長方體形、花瓣形以及一定比例的規(guī)則斜六方體，表面具有多層重疊結構特征，(圖5(a)~(c)所示）。在不同溫度下得到的樣品SEM圖中，對照組CaCO。顆粒形貌有菱形和無規(guī)則塊狀體，分布雜亂無章。實驗組晶體大部分呈花瓣形，黏連在一起(圖5(d)~(f)所示）�？梢娫诓煌瑮l件下，由于加入菌液使得晶體形貌都由常見的不規(guī)則形和菱形變?yōu)榛ò晷魏土襟w形，說明菌株對生成的碳酸鈣的晶體形貌有一定的調控作用。
3結論
(1)在碳酸鈣沉積過程中，pH對碳酸鈣的沉積有一定的影響。在不同的初始pH和溫度下，pH最終趨近于8.0左右，由此得出在pH 8.0左右有利于碳酸鈣的沉積。而溫度在10℃時比其他溫度下對沉積的影響更小，即溫度為10℃下更有利于碳酸鈣沉積的形成。這與菌株本身在10℃、pH 8.0 F有最高的酶活性的代謝機制一致，也與竹文坤等研究的單因素對碳酸鈣沉積的影響結果一致，說明菌株在不同的初始pH值和沉積溫度下對碳酸鈣的沉積有一定的調控作用。
(2)溫度對沉積生成的碳酸鈣的晶體形貌有著較大的影響作用。沉淀物的晶型均為為方解石型，其晶體形貌和堆積密度隨外界條件改變而不同，晶體形貌有菱形、花瓣形、長方體形和無規(guī)則塊狀體。尤其是在不同的溫度下，晶體形貌受溫度影響很大，這與Prah等的研究結果一致。生物的作用使晶體間發(fā)生了黏連，這對利用細菌誘導碳酸鈣沉積進行材料的表面修復工作十分有利。實驗組比對照組有更規(guī)則的晶型，說明加入的供試菌株對碳酸鈣晶體生長和形貌的形成有一定的控制作用。
