生物硫鐵復(fù)合材料對銅暴露斑馬魚的保護(hù)研究
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周婧超， 謝翼飛， 楊陽， 李旭東
(1．中國科學(xué)院成都生物研究所，四川成都610041;
2．中國科學(xué)院大學(xué)，北京100049;
3．中國科學(xué)院環(huán)境與應(yīng)用微生物重點實驗室，四川成都61004.1)
摘要：為了研究生物硫鐵應(yīng)用于銅污染事故應(yīng)急處理中保護(hù)魚類免于死亡的可行性，以斑馬魚為受試對象，測定了銅對斑馬魚的各時間半致死濃度（LC島），考察了投加量、投加時問、pH環(huán)境等條件對銅暴露巾斑馬魚死亡率的影響。結(jié)果表明：投加量越大斑馬魚死亡率越低，最佳投加量（硫化物與銅離子摩爾比）為I:l，此時斑馬魚96 h死亡率由對照組（不投加生物硫鐵材料）的83%降低至OYo；在(24 h-/Cso) mg/L濃度下12 h內(nèi)投加生物硫鐵的斑馬魚死亡率都明{I^低于對照組，超過24 h則與對照基本一致；水體初始pH對生物硫鐵的投加有影響，pH為8時生物硫鐵對銅暴露斑馬魚的保護(hù)效果較好，在(48 h-LG，)mg/L濃度下pH 5投加組和pH 8投加組的斑馬魚96 h死亡率分別由ioo%和77%降低至50%和0%。研究表明，生物硫鐵復(fù)合材料能快速降低水中銅離子濃度，從而保護(hù)魚類免受毒害，其在銅污染事故應(yīng)急處理中具有較好的應(yīng)用前景。
關(guān)鍵詞：重金屬污染；銅；斑馬魚；生物硫鐵；保護(hù)作用
近年來隨著我國經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，重金屬污染事故頻發(fā)，以銅為例，由于廢水排量大和處理不妥引起的銅污染事故，如2010年位于福建上杭縣的紫金山金銅礦因暴雨發(fā)生污水滲漏，事故造成汀江嚴(yán)重污染。銅是一種重要的有色金屬，在紙漿紙板制造、木材及皮革保存以及石油冶煉等工業(yè)中廣泛使用，其對大多水生生物體毒性較大，曾經(jīng)造成沿海地區(qū)牡蠣受銅污染變綠，被我國列為嚴(yán)重污染環(huán)境和危害人體健康的優(yōu)先控制污染物。因此對銅污染事故的應(yīng)急處理顯得尤為重要。
目前在現(xiàn)行應(yīng)急事故處理中，只要以堿沉淀為主。以2012年廣西龍江鎘污染事件為例，主要采用投加弱堿性燒堿沉淀鎘形成氫氧化物，再通過聚氯化鋁絮凝，使其沉淀到河底。但氫氧化物沉淀受水體pH值影響，pH降低會導(dǎo)致再懸浮沉積物重金屬的釋放，在龍江河污染事件處理中，龍江河中的含鎘絮體會在模擬酸性洪水中釋鎘量大，穩(wěn)定性差，對水生生態(tài)環(huán)境具有一定風(fēng)險。
近年來基于硫酸鹽還原功能的微生物已成為處理重金屬研究熱點。硫酸鹽還原菌可以生成硫化物沉淀重金屬，形成稀酸不溶的金屬硫化物沉淀，大大降低生物有效性，成為處理含重金屬廢水的生物修復(fù)方法之一。前期實驗室選育出高產(chǎn)生物硫鐵的菌株，其結(jié)合了微生物處理和物化處理重金屬的優(yōu)點，具有還原性強(qiáng)、比表面積大、不溶的硫化物二次污染的特點，對Cu2+、Cd2+、Pbz咯類重金屬廢水都有較好的去除效果。其粒徑長為45～80 nm，長寬比10～15，其鐵硫原子比為1.07～1.11，主要組分為無定形態(tài)硫化亞鐵和四方硫鐵礦。
雖然關(guān)于硫酸鹽還原菌去除重金屬污染的研究很多，但主要集中在對含重金屬廢水和土壤中的應(yīng)用，尚未見應(yīng)用于水體中防止水生生物死亡的報道。本研究在此基礎(chǔ)上，模擬受銅污染水體，以斑馬魚為對象，開展生物硫鐵材料對銅暴露水體中斑馬魚死亡影響的研究，以期從死亡率變化初步得出生物硫鐵材料的最適投加條件對斑馬魚的保護(hù)作用，為生物硫鐵材料應(yīng)用于銅污染事故水體提供科學(xué)依據(jù)。
1材料和方法
1.1材料
儀器：pH酸度計(PSHJ-3F，上海精密科學(xué)儀器有限公司)，低速大容量離心機(jī)（TDL-5-A，上海安亭科學(xué)儀器廠），原子吸收分光光度計（2-2300，HITACHI公司）
試劑：硫酸銅，分析純，產(chǎn)自天津市美琳工貿(mào)有限公司。
實驗用水：自然光照，水溫(22±1)℃，pH為8.15～8.50，曝氣24 h的除氯自來水，溶解氧>4.5 mg/L，水中未檢出Cu2+。
實驗魚：斑馬魚，購自成都青石橋花鳥市場，雌雄皆有，健康活潑，平均體長(30.25+3.12) mm，平均體重(0.31+0.05)g。在40 cmx23 cmx25 cm的玻璃缸內(nèi)馴養(yǎng)7d，水溫(22±1)℃，飼養(yǎng)密度為1 g/L（即每升水容納斑馬魚的質(zhì)量為1 g），每日光照14 h。馴養(yǎng)過程中每天定時喂食1次，并每天清除排泄物。實驗前1d和實驗期間不喂食。
生物硫鐵復(fù)合材料：生物硫鐵材料生成菌——硫酸鹽還原菌來自本課題組馴化后的純菌株，將馴化后的菌株接種至改良Starkey培養(yǎng)基中，35℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)9～10 d即生成生物硫鐵化合物，取培養(yǎng)物離心分離(5 000 r/min，10 min)，棄去上清液，用去離子水清洗1次，離心分離后的底部沉淀即為硫酸鹽還原菌與納米硫鐵組成的生物硫鐵復(fù)合材料，本實驗以硫化物含量作為生物硫鐵的有效含量。
1.2 方法
1.2.1 Cu2+對斑馬魚LCSo的確定
實驗魚在中毒后鰓蓋停止活動，用玻璃棒或小鑷子輕輕刺激尾柄部分，仍無反應(yīng)即可確定為個體死亡。
在預(yù)實驗基礎(chǔ)上，設(shè)置Cu2+#/e度為0（對照）、0.15、0.25、0.375、0.5、0.75、1.0、1.5 mg/L，共8組，每缸中加4L實驗用水，10尾魚，每個濃度設(shè)置3個平行。采用靜水式換水補藥方法，每隔24 h全部換試液，使Cu2+保持初始，及時撈出死亡個體。分別于24、48、72，96 h觀察并記錄死亡情況，計算死亡率。
數(shù)據(jù)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用概率單位回歸模型，根據(jù)Cu2+對斑馬魚的死亡率和死亡時間分析24、48、72、96 h的半致死濃度/C50和95%置信區(qū)間，安全濃度(safe concentration，SC)按照公式SC=96 h-/C50*0.1計算。作圖數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用Excel作圖。
1.2.2生物硫鐵投加量對銅暴露斑馬魚的影響
選取0.40 mgfL(48 h-/Ci，)Cu2曝露濃度，相同銅濃度下投加生物硫鐵，硫化物與銅離子摩爾比分別為1：1、0.8:1、0.5:1、0.3:1。每組設(shè)置3個平行，4L水，10條魚，采用半靜水式換水補藥加菌方法，24 h換1次試液。另作投加足量生物硫鐵(硫化物與銅離子摩爾比為1:1)對照和只投加Cu2+X寸照，觀察斑馬魚死亡率變化。
1.2.3生物硫鐵投加時間對銅暴露斑馬魚的影響
選取0.71 mg/L（24 h-/C50）作為Cu2+暴露濃度，分別在魚暴露3、6、9、12、24 h時，投加足量生物硫鐵（硫化物與銅離子摩爾比為1:1）。每組設(shè)置3個平行，4L水，10條魚，采用半靜水式換水補藥加菌方法，24 h換1次試液。另作空白對照和只投加Cu2+對照，觀察斑馬魚死亡率變化。
1.2.4水體pH對投加生物硫鐵的銅暴露斑馬魚的影響
選取0.40 mg/L( 48 h-/Cso)作為Cu2+暴露濃度，采用鹽酸和氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值，分別調(diào)節(jié)為pH 5和8，再投加生物硫鐵（硫化物與銅離子摩爾比為0.8:1）。每組設(shè)置3個平行，4L水，10條魚，采用半靜水式換水補藥加菌方法，24 h換1次試液。另設(shè)空白對照和加Cu2調(diào)pH至5和8對照，觀察斑馬魚死亡率變化。
1.2.5生物硫鐵對銅暴露斑馬魚保護(hù)作用的機(jī)理探討
為了測定生物硫鐵對Cu2+的降低效率，設(shè)置3個4L含1.0 mg/L的Cu2+溶液中，一個為只加Cu2+的空白，一個含Cu2+和10條魚的對照，一個含Cu2+和10條魚并投加足量生物硫鐵(硫化物與銅離子摩爾比為1：1)，混勻攪拌后靜置，分別在0、l、4、8、12、16、24 h取樣，測其Cu2+濃度。
2結(jié)果與分析
2.1毒性實驗
2 .1.1中毒癥狀
隨著實驗時間的延長，敲擊實驗容器時，對照組實驗魚能迅速逃離躲避，而高濃度組實驗魚反應(yīng)遲鈍，沒有及時進(jìn)行有效躲避，表明Cu2+對斑馬魚的毒性明顯抑制了斑馬魚的活動能力以及躲避天敵的能力與劉大勝等”州報道的較為一致。Cu2+為1.5 mg/L的高濃度時，8h后即開始出現(xiàn)斑馬魚死亡的現(xiàn)象，24 h死亡率達(dá)到100%，體表粘液分泌增多，鰓絲腫脹，鰓絲上附著有淡藍(lán)色絮狀物�？赡苁荂u2+與斑馬魚分泌的黏膜形成絡(luò)合物，導(dǎo)致斑馬魚體表黏膜缺失并致死。
2.1.2 Cu2+對斑馬魚的/Cr,o
Cu2+對斑馬魚的96 h毒性實驗結(jié)果如表1所示。隨著Cu2+濃度的增大和作用時間的延長，斑馬魚死亡率增大，呈現(xiàn)明顯的劑量一效應(yīng)關(guān)系。由表1中得出Cu2+對斑馬魚24、48、72、96 h的/C50分別為0.71、0.40、0.30、0.23 mg/L，從而得出其安全濃度(1/10 /Ca，)為0.023 mg/L。這與宋志慧等的研究結(jié)果基本相似，但不同時間的/Ca，較宋志慧等研究結(jié)果略微偏低，這可能與所選斑馬魚魚齡偏小有關(guān)。
2.2 生物硫鐵復(fù)合材料的保護(hù)作用
2.2.1生物硫鐵投加量對銅暴露斑馬魚的影響
生物硫鐵不同投加量對斑馬魚死亡率影響見圖1。在0.40 mg/L( 48 h-/Ca，)下，投加足量生物硫鐵（硫化物與銅離子摩爾比為1:1）后，斑馬魚在24 h至96 h的死亡率都降低至0%，死亡率顯著降低；當(dāng)投加量分別為0.5:1、0.8:1時，斑馬魚96 h死亡率相較于對照組的分別從830/,降低至33%和7%。當(dāng)投加量為0.3:1時，斑馬魚的中毒癥狀和死亡率均與對照組無明顯差異，生物硫鐵保護(hù)作用不明顯�？瞻缀椭患由锪蜩F的對照中，斑馬魚沒有異常表現(xiàn)，實驗中也沒有出現(xiàn)死亡，說明生物硫鐵材料對斑馬魚沒有死亡影響：只加Cu2+組斑馬魚中毒癥狀和死亡率與毒性實驗一致。由以上結(jié)果可見，銅暴露同時投加一定量的生物硫鐵可有效降低斑馬魚死亡率，最佳投加量為（硫化物與銅離子摩爾比）1:1。這是因為生物硫鐵跟銅離子主要發(fā)生Cu2++FeS—Fe2++CuS j反應(yīng)，當(dāng)硫化物與銅離子摩爾比為1:1時，體系中所有的銅離子都能與硫化物完全反應(yīng)，能完全生成溶度積更小且穩(wěn)定的CuS沉淀，達(dá)到沉淀Cu2+的目的。
2.2.2生物硫鐵投加時間對銅暴露斑馬魚的影響
生物硫鐵投加時間對斑馬魚的影響見圖2。在0.71mg/L( 24 h-/Cr]，)下，斑馬魚暴露3h投加生物硫鐵沒有死亡。暴露6h投加其24 h死亡率為10%，96 h死亡率為17%；隨著暴露時間的延長死亡率增加，在暴露9h投加生物硫鐵24 h死亡率達(dá)到270h，96 h為330A；暴露12 h投加生物硫鐵斑馬魚24 h死亡率達(dá)到37U/0且96 h為53%；暴露24 h投加生物硫鐵的斑馬魚死亡率與對照組一致。暴露12 h內(nèi)投加生物硫鐵的死亡率都明顯低于對照組，說明暴露一段時間后的斑馬魚再投加生物硫鐵仍能使死亡率降低，而暴露24 h投加生物硫鐵無效。由以上結(jié)果得出，生物硫鐵投加時間越早死亡率越低，受銅污染后越早投加效果越好。重金屬在魚體內(nèi)的吸收、清除始終處于動態(tài)平衡狀態(tài)，當(dāng)魚體處于重金屬污染嚴(yán)重的環(huán)境時，重金屬在魚體的蓄積占主導(dǎo)，一旦脫離則清除占主導(dǎo)。當(dāng)投加生物硫鐵后水中的銅離子濃度降低，對斑馬魚的毒害減小，得到降低死亡率的結(jié)果。所以在一定暴露時間內(nèi)，銅暴露時間越短，受到毒害程度越小，生物硫鐵投加后的死亡率就越低。因此可在重金屬污染處加強(qiáng)監(jiān)測和預(yù)警，為魚類及時規(guī)避毒害響應(yīng)爭取時間。
2.2.3水體pH對投加生物硫鐵的銅暴露斑馬魚的影響
生物硫鐵在pH=5和pH=8條件下投加的影響見圖3。在0.40 mg/L( 48 h-/Ca，)下，對照組中pH=5條件下斑馬魚的死亡率在各個時間段中都明顯高于在對照組pH=8條件下。而投加生物硫鐵后，2種pH條件下的斑馬魚死亡率相對于對照組都明顯下降，pH=5投加組和pH=8投加組的96 h的死亡率分別從100%和83%降低至50%和OoA，而投加生物硫鐵后的pH=5組斑馬魚的死亡率同時段還是高于pH=8投加組。這是由于魚對水體中銅的吸收主要通過鰓這條途徑。懸浮顆粒物對水體中銅的生物有效性的影響，銅在吸收過程以溶解態(tài)攝入，而其它絡(luò)合態(tài)銅不能被魚鰓直接吸收。銅離子濃度越高，魚對其吸收的速率越大。當(dāng)水體pH=5時，水體中的Cu2+比pH=8時濃度更高，所以其死亡率明顯高于在pH=8條件下。即使如此，相比于pH=5對照組，pH=5投加組仍使斑馬魚96 h死亡率從100%降低至60VO，顯著降低死亡率，生物硫鐵在pH=5環(huán)境中也能發(fā)揮一定保護(hù)作用。
2.3生物硫鐵對銅暴露斑馬魚保護(hù)作用的機(jī)理探討
在投加生物硫鐵材料后自然靜置24 h，1.0 mg/LCu2+降低情況如圖4所示。如圖可見，空白組中Cuz+僅略有下降，可能是其在水體中的自然損失所致；對照組中Cu2+與空白組無顯著差異，表明魚對水中Cu2+的自然減少無明顯影響；實驗組中Cu2+明顯降低，24 h后濃度降低了860A。由此表明，生物硫鐵材料對Cu2+有明顯的降低作用，體系中除了Cu2+發(fā)生復(fù)分解反應(yīng)生成CuS沉淀占主導(dǎo)地位¨2J，還有生物硫鐵胞外聚合物EPS吸附途徑，兩者共同作用在吸附、沉淀銅離子中發(fā)揮重要功能。且降低率高、作用時間短，體現(xiàn)了生物硫鐵的高效性。
3結(jié)論
(1)生物硫鐵材料對受銅污染的斑馬魚有保護(hù)作用。其最佳投加量為（硫化物與銅離子摩爾比）1:1，受銅污染后越早投加效果越好，最適投加環(huán)境為pH=8。
(2)生物硫鐵材料能高效的降低水中銅離子濃度，保護(hù)斑馬魚免于銅中毒。經(jīng)自然沉降其24 h降低率可達(dá)到86%。
