�？刹《�25型新型中和實驗方法的建立與應用
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李姝璇，楊立生，侯汪衡，趙歡，萬俊凱，陳夢媛，何水珍，程通，夏寧邵
1．廈門大學生命科學學院，分子疫苗學與分子診斷學國家重點實驗室，國家傳染病診斷試劑與疫苗工程技術(shù)研究中心，福建廈門361102；2．廈門市疾病預防控制中心，福建廈門361021
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[摘要]目的：建立一種新型的快速、高通量的�？刹《�25型(ECH025)中和抗體檢測方法，并初步評價其在ECH025中和抗體篩選和血清流行病學調(diào)查中的應用價值。方法：應用免疫熒光方法篩選ECH025高親和性抗體并將其作為檢測單抗，結(jié)合酶聯(lián)免疫斑點檢測技術(shù)( ELISPOT)建立ECH025中和抗體檢測方法；使用不同效價的血清評價該方法的準確性；采用所建立的中和方法對ECH025單克隆抗體、臨床血清樣品進行檢測。結(jié)果：建立了快速檢測ECH025中和抗體的Nt-ELISPOT方法，以ECH025單克隆抗體589作為檢測抗體；相比經(jīng)典的中和實驗方法Nt-CPE，該方法可顯著縮短檢測時間（從5～7 d縮短至1 d以內(nèi)），檢測結(jié)果具有較好的一致性；采用所建立的Nt-ELISPOT方法首次篩選獲得3株對ECH025具有較好中和能力的單克隆抗體；臨床血清樣品檢測結(jié)果顯示廈門地區(qū)可能存在ECH025的流行。結(jié)論：該方法可以應用于中和抗體篩選和血清學的臨床輔助診斷，為ECH025的防治研究提供支持。
[關(guān)鍵詞]�？刹《�25型；中和實驗；酶聯(lián)免疫斑點法；中和抗體
人腸道病毒是常見的病原體之一，一般表現(xiàn)為隱性感染，但部分患者會出現(xiàn)無菌性腦膜炎、肺水腫、心肌炎等臨床癥狀甚至死亡，其中，無菌性腦膜炎是腸道病毒感染重癥患者最常見的并發(fā)癥。有研究報道，在有效控制乙型腦炎病毒后，腸道病毒，尤其是埃可病毒，在中國已成為引起病毒性腦膜炎的主要病原體，對我國嬰幼兒的健康造成了嚴重威脅。�？刹《�25型(echovirus 25，ECH025)隸屬于小RNA病毒科（Picorn,aviridae）、腸道病毒屬（En一teroviru.s），是人腸道病毒中引起病毒性腦膜炎的常見病原體之一，此外還可引起斑丘疹、急性遲緩性麻痹和肝衰竭等多種疾病。國內(nèi)外均發(fā)生過由ECH025感染引起的散發(fā)病例、局部暴發(fā)或規(guī)模流行。目前，對于ECH025尚無有效的預防或治療方法，相關(guān)研究方法也較為缺乏。
中和抗體檢測對于疫苗免疫原性評價和血清流行病學研究具有重要意義。日前，包括ECH025在內(nèi)的腸道病毒中和抗體檢測主要采用經(jīng)典的依賴于細胞病變效應(cytopathogenic effect assay，CPE)的中和方法(neutralization test based on CPE，Nt-CPE)，檢測周期長、操作繁瑣，不利于開展大規(guī)模的血清流行病學研究。酶聯(lián)免疫斑點檢測技術(shù)( en-zyme linked immunospot assay，ELISPOT)具有檢測準確、快速、高通量的優(yōu)勢，已被用于包括多種腸道病毒在內(nèi)的中和抗體的檢測，如腸道病毒71型(EV71 )、柯薩奇病毒A組16型(CAI6)和B組3型(CB3 )、呼吸道合胞病毒、巨細胞病毒、登格病毒、輪狀病毒等，而ECH025尚未見同類報道。我們以ELISPOT為基礎，探索建立一種新型的快速高效的ECH025中和實驗方法，以期為ECH025的血清流行病學和相關(guān)防治方法研究提供支持。
1 材料與方法
1.1材料
人橫紋肌瘤( thabdomyoma，RD)細胞購白美國模式菌種收集中心(ATCC)，培養(yǎng)于含10% FBS( Gihco)的MFM培養(yǎng)基中；ECH025毒株XM2013-0297( GenBank No. KP099941)分離自2013年廈門地區(qū)手足口病患者咽拭子臨床標本；手足口病疑似患者血清樣品由廈門市疾病預防控制中心提供。
1.2抗體制備
以熱滅活的ECH025( l.2xl08 TCID，。/mL)作為免疫原與弗氏佐劑（Sigma）等體積混合，采用皮下多點注射方式免疫6—8周齡SPF級BALB/c雌鼠（上海斯萊克實驗動物有限公司），分別于第2、4、6周進行加強免疫。初次免疫采用完全弗氏佐劑，加強免疫時采用不完全弗氏佐劑，末次免疫為直接向脾臟注射病毒。應用雜交瘤技術(shù)，以PEG4000( Sigma)為融合劑，將免疫小鼠脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞按5:1的比例融合，在含HAT( Sigma)的1640選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)。以滅活ECH025( 2.5x l05 TCIDso/mL)作為包被抗原，辣根過氧化物酶( HRP)標記的羊抗鼠抗體（1gG，Sigma）為二抗，應用間接酶聯(lián)免疫吸附法( ELISA)檢測融合細胞培養(yǎng)卜清，通過有限稀釋法對陽性克隆孔進行克隆。將單克隆抗體細胞打入小鼠腹腔誘導腹水，用硫酸銨鹽析法和Protein A親和層析法純化小鼠腹水。采用經(jīng)典過碘酸鈉( Nal0。)法對單克隆抗體進行HRP標記1221，保存于-20C。
1.3免疫熒光檢測(lFA)
將RD細胞加入預先鋪有玻片的24孔細胞培養(yǎng)板中，感染10 uL腸道病毒；14 h后，每孔加入100uL 4%多聚甲醛，室溫避光30 min;用0.3% TrionX-100通透細胞10 min，山羊血清封閉th；以本實驗室制備的ECH025單克隆抗體為一抗，37。C孵育1 h；以異硫氰酸熒光素( FITC)標記的羊抗鼠抗體(IgG，Sigma)為二抗，37C反應30 min;加入DAPI(Invitrogen)核染5 min后．熒光顯微鏡(TE2000，Nikon)下觀察并拍照。
1.4 Nt-ELISPOT應用于中和抗體檢測
將待測樣品（血清樣品須56C滅活30 min）加入96孔U形板中，按1/2的梯度從1：8稀釋至1：8192，加入等體積的ECH025病毒懸液，37C孵育lh；取100 uL混合物加至預鋪有RD細胞(20 0001孔)的96孔細胞培養(yǎng)板中，370C、5% CO2培養(yǎng)。14 h后如下進行酶聯(lián)免疫斑點實驗：每孔加入IOO uL0.2%的戊二醛同定液，室溫避光1 h；加入1%的Tri-ton X-100通透液，室溫靜置30 min；加入HRP標記的ECH025特異性單克隆抗體589，37。C孵育30min；用PBST(PBS+0.5% Tween 20)漂洗5次，加入TMB顯色液（Sigma），37。C顯色10 min;通過酶聯(lián)斑點分析儀(Cellular Technology Limited，CTL)掃描和藍色斑點數(shù)統(tǒng)計，按下式計算感染抑制率(P):
其中，N。，代表實驗孔的斑點數(shù)，N。11。。，，，和NirLJ.。。。分別代表未感染病毒的RD細胞和感染病毒的RD細胞的每孔平均斑點數(shù)。樣品的中和效價定義為：P值≥50%時的最高稀釋率。
1.5 Nt-ELISPOT應用于中和性單克隆抗體篩選
取50 uL本實驗室前期制備的ECH025單克隆抗體(1 mg/mL)加入96:fL U形板中，按1/2的梯度從1：8稀釋至1：8192，與等體積的ECH025( 1.5×10'TCID，。／孔)混合，37℃孵育1 h；取100 uL混合物加至預鋪有RD細胞（20 0001孔）的96孔細胞培養(yǎng)板中，置37。C、5% CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)14 h后按卜-述方法進行酶聯(lián)免疫斑點實驗并計算樣品的中和效價。將中和效價≥16的樣品判定為ECH025中和性單克隆抗體。
2 結(jié)果
2.1 ECH025 Nt-ELISPOT方法的建立
應用免疫熒光法，我們從前期獲得的ECH025單抗中篩選獲得一株單克隆抗體589（IgGl亞型），該單抗對感染ECH025后的RD細胞具有較好的反應活性，對未感染病毒的RD細胞無明顯反應(圖1A)。我們對單克隆抗體589進行HRP標記，應用ELISPOT方法分別對ECH025、EV71和CA16等腸道病毒感染后的RD細胞進行檢測，結(jié)果顯示HRP標記的589在1：10000稀釋度下可以特異識別被ECH025感染的RD細胞，在加入顯色底物TMB后，被感染的細胞顯示為藍色斑點；而不能識別被EV71、CA16、CB3和ECH030感染的RD細胞(圖1B)，具有良好的檢測特異性。我們進一步探索了不同的病毒感染劑量對ELISPOT檢測實驗的影響，將ECH025(1.2x107 TCID，．，/mL)以1/2梯度進行系列稀釋并分別感染RD細胞，感染14 h后用HRP標記的589進行ELISPOT檢測。結(jié)果如圖1C所示，檢測斑點數(shù)與病毒感染劑量呈正相關(guān)，當病毒感染劑量為1.9x104—1.5xi05 TCID；．，／孔時，檢測斑點數(shù)與病毒感染劑量的對數(shù)值具有較好的線性關(guān)系( R2=0.9924)。通過分析，本研究選擇以HRP標記的單克隆抗體589（1:10 000稀釋）為檢測抗體，病毒感染劑量為1.5x10s TCIDs。1／孔，感染時間為14 h，以上述條件建立ECH025中和抗體檢測方法Nt-ELISPOT。
2.2 Nt-ELISPOT方法與經(jīng)典Nt-CPE方法的一致性分析
依賴于細胞病變效應的Nt-CPE方法是檢測腸道病毒中和抗體的“金標準”方法。為評價本研究建立的ECH025 Nt-ELISPOT方法與經(jīng)典Nt-CPE方法的一致性，首先用經(jīng)典Nt-CPE方法篩選獲得4份血清，分別為ECH025抗體陽性人血清（中和效價為1：1024）、ECH025免疫小鼠血清(中和效價為1：4096)、ECH025抗體陰性人血清（中和效價<1: 16）和ECH025抗體陰性小鼠血清（中和效價<1: 16）。將上述4種血清樣品分別以1/2梯度稀釋，應用本研究建立的Nt-ELISPOT方法分別檢測稀釋后的血清樣品的ECH025中和抗體效價。結(jié)果顯示，2份ECH025抗體陽性血清樣品（圖2A、B）的中和效價均隨血清稀釋率的增加按1/2梯度下降，與預期效價具有良好的一致性，而ECH025抗體陰性血清樣品的中和效價均<1: 16（圖2C、D）。-卜述結(jié)果說明，本研究建立的Nt-ELISPOT方法與經(jīng)典Nt-CPE方法的檢測結(jié)果具有較好的一致性。
2.3 Nt-ELISPOT方法應用于抗ECH025中和單抗的篩選
進一步應用建立的Nt-ELISPOT方法檢測前期獲得的ECH025單克隆抗體的ECH025中和效價，篩選獲得3株ECH025中和單抗，分別為2E9(IgG2a)、4G2 (IgG2a)和14H7 (IgM) -Nt- ELISPOT檢測結(jié)果顯示，3株單抗均可阻斷ECH025對RD細胞的感染（圖3A），其中和效價分別為1：8192、1：2048和1：256（圖3B）。免疫熒光檢測結(jié)果顯示，上述3株中和單抗與ECH025感染后的RD細胞具有良好的反應性（圖3C）。
2.4 臨床樣本檢測
隨機選取廈門地區(qū)80份2014年手足口病疑似患者血清標本（男性患者51例，女性患者29例，平均年齡2.3歲），用本研究建立的ECH025 Nt-ELISPOT方法對其進行檢測，以1:16為中和抗體陽性判定標準。結(jié)果顯示，80份血清樣品中有43份為ECH025中和抗體陽性，陽性率為53.75%（圖4），提示ECH025在廈門地區(qū)人群中可能存在流行感染。
3討論
腸道病毒的流行病學調(diào)查主要依賴于采用RT-PCR方法檢測樣品中病毒核酸含量，但該方法受限于病毒在宿主體內(nèi)存活時間的影響。相比而言，血清抗體水平檢測可反應病毒的當前或既往感染情況。同時，中和抗體被認為是評價疫苗免疫原性的關(guān)鍵指標。因此，對于病毒流行病學調(diào)查或防治方法研究，中和抗體檢測方法的準確性與高效性均具有重要意義。
Nt-CPE方法是經(jīng)典的腸道病毒中和抗體檢測方法，但存在一些不足，如實驗周期長，通常需要5~7 d；操作過程繁瑣，不適于大量標本的檢測；依靠肉眼觀察，結(jié)果存在一定的主觀誤差。因此，腸道病毒新型中和實驗方法不斷出現(xiàn)。Huang等依據(jù)ELISA法建立了檢測EV71中和抗體方法，將檢測時問縮短至2 d。隨后建立的基于假病毒的中和抗體檢測方法，相對活病毒而言操作更加安全。我們以ELISPOT方法為基礎，探索建立了ECH025的新型中和抗體檢測方法。ELISPOT方法已成功應用于腸道病毒EV71、CB3、CA16等中和抗體的檢測，該方法僅需一臺酶聯(lián)斑點分析儀和一株能夠與待洲樣品特異性結(jié)合的單克隆抗體，將抗體進行HRP標記后即可捕獲被病毒感染的細胞，當加入顯色底物TMB時，被感染的細胞被染成藍色，從而區(qū)別于未被病毒感染的細胞。Nt-ELISPOT方法依賴于特異性抗體與病毒蛋白的相互作用，不須等待細胞病變的發(fā)生，1d內(nèi)即可完成檢測。此外，96孔板及酶聯(lián)斑點分析儀的應用便于結(jié)果分析與保存，大大提高了檢測通量，也避免了經(jīng)典Nt-CPE方法帶來的主觀誤差。
目前，ECH025相關(guān)研究尚局限于毒株的分離與基因序列的進化分析，研究基礎較為薄弱。本研究應用Nt-ELISPOT方法首次篩選獲得3株ECH025中和性單克隆抗體，可以為進一步開展ECH025中和表位和相關(guān)疫苗研究提供條件。同時，通過對隨機選取的廈門地區(qū)的80份手足口病疑似患者血清進行中和抗體檢測，發(fā)現(xiàn)53.75%的血清樣品顯示ECH025抗體陽性，表明ECH025在廈門地區(qū)可能存在流行感染，有待開展更深入和全面的研究。已有研究顯示，多種腸道病毒之間存在共感染和共流行現(xiàn)象。在我們通過檢測獲得的ECH025抗體陽性的人血清樣品中，部分樣品經(jīng)RT-PCR檢測顯示含有EV71、CA6等不同型別腸道病毒核酸，表明廈門地區(qū)可能存在ECH025與EV71、CA6或其他腸道病毒共感染情況，提示我們應當進一步提高腸道病毒診斷技術(shù)，加強對多種腸道病毒流行情況的全面監(jiān)測。
綜上所述，本研究建立的人腸道病毒ECH025新型中和實驗方法具有特異性強、耗時短和通量高等優(yōu)點，為快速、高效開展ECH025血清流行病學調(diào)查及相關(guān)防治方法研究提供了支持，同時也可為其他病毒中和抗體檢測方法的建立提供參考。
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