人乳頭瘤病毒6/11型L2片段的高效表達及免疫效果評價
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任皎，張忠獻，趙莉，郝明強，田厚文，譚文杰，阮力
1．中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所，北京102206;
2．鄭州大學中英分子腫瘤學研究中心，河南鄭州450052
[摘要]目的：原核表達人乳頭瘤病毒( HPV)6型和11型L2 N端融合蛋白，并初步評價其免疫效果。方法：用重疊PCR將HPV6和HPVI1次要衣殼蛋白L2基因5 ’端片段融合，并在大腸桿菌中表達融合蛋白，純化后與Al(OH)，佐劑配伍肌肉注射免疫BALB/c小鼠，用ELISA檢測血清抗體，以基于假病毒的體外中和試驗評價中和抗體水平。結(jié)果：ELISA結(jié)果顯示，3種融合蛋白均能產(chǎn)生針對同型別L2蛋白的高滴度特異性IgC抗體，滴度為1:10 000～1:200 000;體外中和試驗顯示，3種融合蛋白均能誘發(fā)中和抗體和交叉中和抗體，針對同型別的滴度最高可達1：3200，對于高危型能產(chǎn)生一定水平的交叉中和抗體，滴度為1:50～1: 800。結(jié)論：HPV6/11 L2融合蛋白能夠誘發(fā)較強的體液免疫反應(yīng)，產(chǎn)生較高的中和抗體及交叉中和抗體，為HPV L2新型預防性疫苗的研究提供了初步的實驗基礎(chǔ)。
[關(guān)鍵詞] 人乳頭瘤病毒；融合蛋白；預防性疫苗，中和抗體，次要衣殼蛋白L2
人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）是一組嗜上皮組織的小雙鏈DNA病毒，具有嚴格的種屬特異性和組織特異性，僅感染人的皮膚和黏膜上皮，并且不同型別的HPV對機體不同部位的皮膚和黏膜的嗜向性不同。HPV主要引起皮膚、黏膜的良、惡性腫瘤，目前已發(fā)現(xiàn)100多型，其中30多種型別與口腔、生殖道黏膜腫瘤形成有關(guān)。根據(jù)這些HPV致瘤性的不同又可分為2組：低危型，主要包括HPV6、11，導致以尖銳濕疣為主的良性生殖疣以及復發(fā)性呼吸道乳頭瘤病(recurrent respiratory papil-lomas，RRP)等良性病變；高危型，主要以HPV16、18型為主，與宮頸癌的發(fā)生關(guān)系最為密切，其次為45、31、33、52、58型等。因此，HPV疫苗研究意義重大。
早在上世紀90年代初HPV疫苗研究就已展開，2006年成功上市。其中默沙東( Merk)公司的HPV預防性疫苗Gardasil，是由HPV6、11、16和18型的L1病毒樣顆粒(VLP)組成的四價疫苗；葛蘭素史克( GSK)公司的HPV預防性疫苗Cervarixl31，是由HPV16、18型的Ll VLP組成的雙價疫苗。上述疫苗對同型別HPV的保護率為100%，可以預防70%宮頸癌的發(fā)生。而2014底默沙東公司的Gardasil 9（9價HPV Ll VLP疫苗）上市，能預防90%的宮頸癌發(fā)生。盡管如此，這種Ll形成的VLP疫苗制備成本高，難以在全球廣泛推廣；且具有型別特異性缺乏交叉保護作用，不能預防其他型別的HPV感染。因此，要在全球范圍內(nèi)特別是貧窮落后地區(qū)預防宮頸癌的發(fā)生，還需要研發(fā)安全、有廣譜效果，且價格低廉的新型疫苗。
HPV次要衣殼蛋白L2具有廣譜中和表位，同時L2類疫苗為線性表位，可在原核系統(tǒng)中表達生產(chǎn)，工藝簡單，造價低廉。與基于L1蛋白的VLP疫苗相比，雖然L2蛋白誘發(fā)的特異性抗體滴度較低，但佐劑的使用目前已使L2疫苗的研究取得了一些新進展。已有諸多研究表明，其N端蛋白片段可誘發(fā)動物產(chǎn)生具有交叉中和活性的抗體，并能保護動物免受其他型別病毒的攻擊。因此，HPV L2具備作為第二代新型HPV預防性疫苗的研發(fā)潛力。
我們根據(jù)我國流行病學資料選擇主要HPV流行型別，在前期本課題組已構(gòu)建并篩選出能誘導高滴度中和抗體的高危型HPV18/16/58型（三價）L2融合蛋白疫苗的基礎(chǔ)上，本研究選擇低危型HPV6和HPV11型，將其編碼L2 N端具有交叉中和活性區(qū)域的基因融合，在原核表達系統(tǒng)中表達純化融合蛋白，評價篩選能誘發(fā)中和抗體和交叉中和抗體的融合蛋白，為五價融合蛋白疫苗的構(gòu)建奠定基礎(chǔ)。
1 材料與方法
1.1材料
6～8周齡雌性BALB/c小鼠購自中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所；293FT細胞購自Invitrogen公司；大腸桿菌DH5a、BL21( DE3+)感受態(tài)細胞由本課題組制備；HPV6、45型假病毒為中國食品藥品檢定研究院吳雪伶贈送；pMD18-T載體(TaKaRa#D103A)、pET- 9a載體、攜帶HPV6b全長基因的pBR322-HPV6b克隆質(zhì)粒、攜帶HPV11 L2 E7基因的pUC-HPV11L2E7克隆質(zhì)粒均為本實驗室保存；用于HPV假病毒包裝的含密碼子優(yōu)化4種不同型別HPV結(jié)構(gòu)蛋白L1、L2基因的表達質(zhì)粒(pllLlw，p11L2w，she1116，she1118，she1152，she1158)、攜帶綠色熒光蛋白報告基因的質(zhì)粒pfwb為美國國家癌癥研究所John T．Schiller教授惠贈；PCR引物合成自上海生T公司；Pfu、Taq酶購白北京天根公司；限制性內(nèi)切酶、T。DNA連接酶購白NEB公司；IPTG購白北京欣經(jīng)科公司；Western印跡一抗（HPV6b L2鼠多抗）由本課題組制備；HRP標記羊抗鼠二抗購自北京中杉金橋公司；His-Bind純化介質(zhì)購自Amersham公司；ELISA包被抗原各型別L2蛋白由本課題組制備；其他化學試劑為國產(chǎn)分析純。
1.2構(gòu)建L2融合片段及其表達質(zhì)粒
各型別L2基因片段通過PCR獲得，型別間片段的融合采用重疊PCR方法，其中HPV L2融合基因的5 7端含Nde I酶切位點，3 7端含BglⅡ酶切位點，且各融合片段5 7端均帶有6個組氨酸標簽以便純化。重疊PCR擴增獲得的HPV6、HPV11 L2 5 7端不同大小的融合基因片段見表1，通過NdeI和BglⅡ酶切位點插入原核表達載體pET-9a。
1.3融合蛋白表達、鑒定與純化
將含目的基因的pET-9a表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3+)菌株，挑單克隆接種于含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃、250 r/min振蕩培養(yǎng)過夜；將菌液按1：100的比例轉(zhuǎn)接到新鮮LB中，370C、250 r／min振蕩培養(yǎng)3 h，至D600。，，值為0.8，加入IPTG至終濃度為1mmol/L,于37qC誘導表達2.5 h；收集菌體重懸于裂解液中，經(jīng)冰浴超聲波破碎后，分別收集上清和沉淀，SDS-PAGE分析融合蛋白的表達形式，Western印跡（一抗?jié)舛?：200，二抗?jié)舛?:5000）鑒定融合蛋白，用His-Bind親和層析純化融合蛋白。
1．4小鼠免疫接種
采用隨機分組方法將24只6～8周雌性BALB/c小鼠分為4組，即3個融合蛋白組、1個PBS對照組，每組6只。選擇Al(OH)，作為佐劑，每組蛋白用量20 p4g/只，Al( OH)，100 Vg/只，均于小鼠左后下肢肌注。初免4周后加強，加強2周后采血評價。
1.5 ELISA檢測血清中HPV L2的總抗體水平
以各自型別的L2蛋白或融和蛋白作為包被抗原，分別為HPV6 L2、HPV11 L2E7、HPV16 L2、HPV18 L2、HPV58 L2蛋白，包被抗原200 ng/孔，4℃包被過夜，PBST洗板后用含5%小牛血清的PBS 37C封閉1h，加入稀釋后血清，37C孵育2h，洗板后加入二抗（濃度1:10 000），37。C孵育1 h，洗板后加入底物顯色，2～3 min后終止反應(yīng)，酶標儀讀取D450nu，值。
1.6假病毒的制備
預先鋪6xl06／15 mL 293FT細胞于75CIll2細胞培養(yǎng)瓶中，置37℃、50/0 CO：孵箱中培養(yǎng)，待細胞匯合達60%，用LipofectAMINE 2000將結(jié)構(gòu)基因表達質(zhì)粒( p6LLw、pllLLw、p16LLw、p18LLw、p45LLw、p52LLw、p58LLw)分別與報告質(zhì)粒pfwb共轉(zhuǎn)染293FT細胞，48 h后收集細胞，加入與細胞沉淀等體積的細胞裂解液（0.5%的Brij58），混勻，37。C孵育24 h，取出細胞裂解液，冰浴5 min后加入0.17倍體積的5 mol/L的NaCl溶液，使鹽濃度調(diào)整為850mmol/L，冰浴10—20 min，5000 r/min離心20 min，取上清，分裝，并于-70℃凍存?zhèn)溆谩?
1.7體外中和試驗
鋪293FT細胞于96孔板(每孔細胞數(shù)2.0x 104/100 uL)中，置37qC、5% C02孵育過夜；將各型假病毒分別稀釋至200 TCID，。，/50 uL，將待測血清從1：25開始梯度稀釋，同時設(shè)立陰性血清對照及空白對照；在96孔板上每孔加入80uL病毒稀釋液及80VL陽性血清稀釋液，混勻，4℃放置1 h；從各孔中吸取100 uL假病毒血清混合物，貼壁緩緩加入預先已鋪好細胞的96孔板中，輕拍四周混勻；將細胞繼續(xù)培養(yǎng)72 h，以感染抑制率大于50%的最高血清稀釋度的倒數(shù)作為血清的中和滴度。
2結(jié)果
2.1 原核表達質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定
PCR擴增出HPV6b L2-88、HPV6b L2-200、HPV11 L2-88、HPV11 L2-200各基因片段，然后經(jīng)重疊PCR擴增獲得融合基因片段HPV6/11-88/88，HPV11/6- 200/200、HPV11/6- 200/88（表1），經(jīng)酶切消化后插入pET質(zhì)粒相應(yīng)位點，重組質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定后測序，結(jié)果表明pET- 6/11- 88/88、pET- 11/6-200/200、pET-ll/6-200/88中目的基因序列與設(shè)計序列相符。
2.2 HPV6、HPV11 L2 N端不同大小片段融合蛋白的表達及鑒定
取100 uL菌液到微量離心管中，12 000 r/min離心1 min，棄上清，加入50 uL lxSDS上樣緩沖液，混勻，煮沸5 min，取5uL上樣于12%的SDS-PAGE膠中，經(jīng)電泳、考馬斯亮藍染色后觀察蛋白表達情況。結(jié)果（圖1）分別在相對分子質(zhì)量約isxi03、37xi03和58xl03處出現(xiàn)明顯新增蛋白表達條帶，除HPV6/11-88-88外，其余2個融合蛋白均比預測分子大，這可能與HPV L2的特殊二級結(jié)構(gòu)有關(guān)，也與其他文獻報道相似。Western印跡（圖2）結(jié)果也顯示在對應(yīng)分子大小處出現(xiàn)特異性反應(yīng)條帶，說明目的蛋白在大腸桿菌中獲得正確表達。
2.3 HPV6/11 L2 N端各融合蛋白的純化
由于HPV6/11 L2 N端不同大小片段融合蛋白的C端據(jù)均有6個組氨酸標簽，因此選用His-bind親和層析柱純化目的蛋白。以HPV11/6-200/200蛋白為例闡述目的蛋白的純化過程：用3個柱床體積緩沖液(50 mmol/IJ Tris-HCl pH8.0,0.5 mol/L NaCl,8 mol/L尿素)洗脫未結(jié)合的蛋白，再用50 mmol/L咪唑洗脫緩沖液（50 mmol/L咪唑，50 mmol/L Tris-HCl pH8.0,0.5 mol/L NaCl，8 mol/L尿素）洗脫雜質(zhì)蛋白，最后用150 mmol/L咪唑洗脫緩沖液(150mmol/L咪唑，50 mmol/L Tris-HCI pH8.0,0.5 mol/L NaCl，8 mol/L尿素）洗脫目的蛋白。透析除去尿素后經(jīng)SDS-PAGE分析，純化的3種目的蛋白分子大小與預期相符（圖3）。用Gel-Pro Analyzer 3.1軟件分析，3個蛋白的純度均達到90%以上。
2.4 HPV6/11 L2 N端各融合蛋白的免疫效果評價
2.4.1 HPV6/11 L2 N端各融合蛋白所誘發(fā)的總1gG水平小鼠免疫結(jié)束2周后，收集分離血清，以正常小鼠血清為陰性對照，分別以HPV6 L2、HPV11 L2、HPV16 L2、HPV18 L2、HPV58 L2蛋白為包被抗原，ELISA檢測1gG水平。結(jié)果見圖4，各融合蛋白組小鼠血清中均檢測出針對同型HPV L2蛋白的特異性高滴度1gG抗體，滴度為1:10 000—1:200000，且針對高危型別16、18、58的抗體滴度也在1：1000～1:32000之間。
2.4.2 HPV6/11 L2 N端各融合蛋白所誘發(fā)的中和抗體及交叉和中和抗體水平每組BALB/c小鼠免疫后血清6份，各取50 111，混勻后共300 p4L，1:5稀釋，用微型過濾器過濾除菌，置-30。C保存。分別利用HPV6、11、16、18、45、52和58型假病毒中和試驗檢測各組小鼠免疫后血清的中和抗體水平，各血清從1:25開始稀釋，抑制率大于50%的最大稀釋倍數(shù)的倒數(shù)作為血清的中和滴度。結(jié)果顯示，3種融合蛋白均能誘發(fā)出中和抗體和交叉中和抗體，針對同型別的滴度高，最高可達1：3200，對于其他基因型也產(chǎn)生一定水平的中和抗體，滴度從1：50到1：800不等。HPV6/11二價融合蛋白200/200針對同型的中和抗體滴度比其他2種融合蛋白高。針對高危型交叉中和抗體中，以52型為高(1: 800)，針對16、1 8型的交叉中和抗體水平較低(1：50)。結(jié)果見圖5。
3討論
理想的疫苗不但要保護范圍廣，而且要價格低�，F(xiàn)已上市的HPV Ll VLP疫苗雖然能有效預防HPV感染及相關(guān)疾病的發(fā)生，但其成本高、價格昂貴，同時保護具有明顯型別限制性的缺點，即使2014底默沙東公司的Gardasi19上市，能預防90%的宮頸癌發(fā)生，但仍有10010的宮頸癌得不到預防。L2蛋白作為HPV的次要衣殼蛋白，序列高度保守，能誘導產(chǎn)生交叉中和抗體，且中和抗體表位為線性，可在成本低廉的大腸桿菌系統(tǒng)中表達制備，因此其在二代HPV預防性疫苗研發(fā)中具有很好的前景。本研究獲得的HPV6/11 L2融合片段免疫小鼠后能誘發(fā)強的體液免疫反應(yīng)，其抗體不但能中和融合蛋白中含有的HPV型別（HPV6/1），而且還能中和未包含在融合蛋白中的型別( HPV16、18、45、52、58)。融合蛋白免疫產(chǎn)生范圍廣的免疫反應(yīng)，可能是由于在融合構(gòu)建時，識別多種HPV型別共有的L2特異性中和抗體表位的B細胞被激活，使免疫反應(yīng)交互增強，這種增強更傾向于交叉中和抗體的產(chǎn)生。
我們的結(jié)果與之前的發(fā)現(xiàn)的HPV L2的中和表位主要集中在N端前200個氨基酸殘基( 17～36、20—38、36～49、69～81、108—120等)的結(jié)果一致。此前Jagu等研究多型別L2融合蛋白免疫兔子和小鼠的結(jié)果也提示，多型別L2融合能誘發(fā)比單一型別更高滴度的中和抗體和交叉中和抗體。但不同的融合片段11- 200×3（HPV6、16、18型）、11- 88×5（HPV1、5、6、16、18型），或17-36x22（5種皮膚型別，2種黏膜低危型，以及15致癌基因型）的結(jié)果不同，其中l(wèi)l-88x5誘發(fā)中和抗體和交叉中和抗體的能力最強。Rubio等發(fā)現(xiàn)細菌硫氧還蛋白展示的串聯(lián)的HPV16 L2(20-38)能誘導強的免疫反應(yīng)，能中和HPV18、58、45、31型假病毒，但不同數(shù)目的融合片段產(chǎn)生的抗體反應(yīng)滴度不同。這些提示我們不同片段的組合方式對HPV L2的免疫原性有影Ⅱ向。我們獲得的3種融合蛋白的結(jié)果也證實各個片段不同的排列組合方式對免疫原性有一定的影響。此外，我們在構(gòu)建融合基因時，其他幾種基因排列融合結(jié)構(gòu)的蛋白沒能獲得有效表達。
L1 VLP即便是在無佐劑的情況下也能誘發(fā)滴度高、持續(xù)時問長的保護性抗體反應(yīng)，L2融合蛋白誘發(fā)產(chǎn)生的中和抗體比前者低，有效的佐劑選擇就顯得十分重要。本研究中我們只使用了Al(OH)，佐劑；McGarvie等用1mg牛乳頭瘤病毒4(BPV4) L2同弗氏不完全佐劑一起免疫2次，免疫1年后還可以保護牛免受BPV4的攻擊。Jagu等報道了ll-88x5( HPV1、5、6、16、18)不同佐劑的使用情況，對于融合蛋白中沒有的型別體外中和試驗中和抗體，Al( OH)，和單磷脂A( MPL)或CpG混合使用比單獨使用鋁佐劑的效果好，對于融合蛋白中含有的HPV型無差別。早期的研究觀察到用ll-200x3免疫4個月后用HPV16假病毒攻擊，結(jié)果表明鋁佐劑和ISS1018共用比單獨使用鋁佐劑保護程度高。這提示我們選擇合適的佐劑能改善HPV L2融合蛋白的免疫反應(yīng)，并極有可能使HPV L2融合蛋白作為新型疫苗的研究走向一個新階段。
后期我們將用構(gòu)建的HPV6/11二價融合蛋白基因與高危型HPV16/18/58三價融合蛋白基因融合構(gòu)建五價HPV16/18/58/6/11 L2融合基因。考慮到原核高效表達對基因片段長度有一定的限制，且多型別片段的融合還可能進一步增強免疫效果，所以將首選分子小的低危型HPV6/11-88/88片段與高危型三價HPV18/16/58片段融合并進行表達，評價其免疫效果，為我國HPV二代預防性疫苗的研發(fā)提供科學依據(jù)。
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