利用CRISPR/C as系統(tǒng)構建在XRCC6內(nèi)源基因插入Flag標簽序列的HeLa細胞系
李瑞花，付漢江，沈遠，鐘一然，朱捷，鄭曉飛
1．軍事醫(yī)學科學院放射與輻射醫(yī)學研究所，放射生物學北京市重點實驗室，北京100850;
2．安徽醫(yī)科大學研究生學院，安徽合肥230032
[摘要]目的：利用CRISPR/Cas系統(tǒng)在XRCC6基因5’端插入Flag標簽序列，篩選XRCC6-Flag穩(wěn)定表達的宮頸癌細胞( HeLa)株。方法：根據(jù)GenBank中XRCC6基因序列，設計XRCC6基因敲入的gRNA序列，構建入pCas-Cuicle載體中，獲得pCas-XRCC6載體；設計XRCC6基因的同源臂序列，利用搭橋PCR方法將同源臂和F'lag標簽序列作為模板進行擴增，得到供體DNA片段，并將其克隆到pBackZero-T表達載體上，獲得pXRCC6-Donor載體；將上述2個載體共轉染H。La細胞，采用PCR.W。。t。。n印跡等方法檢測和篩選Flag標簽序列插入XRCC6基因5 ’端的細胞株。結果：構建了pCas-XRCC6和pXRCC6-Donor載體，篩選獲得3株XRCC6-FIag穩(wěn)定表達細胞株。結論：構建了XRCC6-Flag穩(wěn)定細胞株，為研究XRCC6基因及其蛋白產(chǎn)物的生物學功能奠定了基礎。
[關鍵詞]CRISPR/Cas系統(tǒng)；XRCC6基因；Flag標簽
近年來，鋅指核酸酶(zinc finger nuclease,ZFN)、轉錄激活因子效應物核酸酶(transcription ac-tivator-like effect nucleases,TALEN)、規(guī)律成簇間隔短回文重復序列(clustered regularly interspacedshort palindromic repeat, CRISPR)及其相關基因(CRISPR-associated genes，Cas)系統(tǒng)等基因編輯技術的發(fā)展，為在生物體內(nèi)和細胞中對基因組進行編輯和基因功能研究提供了簡便高效的技術方法。CRISPR/Cas作為一種新型基因編輯工具，可以高效地在內(nèi)源環(huán)境中選擇性改變機體基因組DNA的功能，這為生物學和醫(yī)學等方面的研究提供了條件。
CRISPR/Cas系統(tǒng)最早在古細菌和細菌中發(fā)現(xiàn)，是長期進化過程中形成的一種適應性免疫防御系統(tǒng)，避免病毒或質粒等外源DNA的侵入。根據(jù)Cas基因核心元件序列的不同，可將CRISPR/Cas系統(tǒng)分為3種類型，其中Ⅱ型CRISPR/Cas系統(tǒng)被改造后廣泛應用于基因組的編輯。利用CRISPR/Cas系統(tǒng)將器官、細胞基因組DNA序列進行刪除、插入或修飾，有利于研究基因或調節(jié)元件的具體功能。CRISPR/Cas系統(tǒng)由一段特異的長度約20 bp的靶向序列、通用結構支架和Cas9核酸內(nèi)切酶組成。20bp的靶向序列和通用結構支架形成一個復合體，稱作sgRNA(single guide RNA)，sgRNA通過堿基互補配對與基因組靶位點NGG[protospacer adjacent mo-tif( PAM)，前問區(qū)序列鄰近基序]后緊隨的20 bp序列結合，并引導Cas9核酸內(nèi)切酶在PAM上游第3個堿基處引發(fā)DNA雙鏈斷裂。雙鏈DNA的斷裂會激活細胞內(nèi)部的DNA損傷修復應答反應，利用非同源末端連接修復機制或同源重組修復機制對斷裂位點進行修復。非同源末端連接修復容易造成錯配或片段丟失，因此利用非同源末端連接修復機制修復可以進行某基因敲除或DNA片段刪除。同源重組修復是精確修復，當帶有損傷位點兩側同源序列的模板存在時，會發(fā)生同源重組修復，通過在2條同源臂之問加入外源DNA序列，可以在斷裂位點插入一段其他的DNA序列，從而在斷裂位點插入新的遺傳信息。CRISPR/Cas系統(tǒng)利用了簡單的堿基互補配對原則，在基因組的PAM前面設計一段適當?shù)拈L度為20 bp的gRNA，CRISPR/Cas系統(tǒng)能夠將該處DNA雙鏈發(fā)生特異性斷裂。人類基因組大約每810 bp就包含一個PAM，因此CRISPR/Cas系統(tǒng)幾乎能靶向人類的任意基因。CRISPR/Cas技術已在工業(yè)、農(nóng)業(yè)及基因治療等方面得到廣泛應用，在人類細胞、斑馬魚、小鼠中實現(xiàn)了基因組定點編輯。
XRCC6(X-ray complementing defective repair inchinese hamster cells 6)在DNA損傷修復中具有重要的生物學功能。我們利用以上原理，在XRCC6基因5 ’端插入Flag標簽序列，XRCC6基因表達的蛋白（Ku70蛋白）與Flag標簽蛋白融合，融合后的XRCC6- Flag蛋白不會改變先前XRCC6蛋白的功能，為研究XRCC6基因及其蛋白產(chǎn)物的生物學功能奠定了基礎。
1 材料與方法
1.1材料
HeLa細胞由實驗室保存；大腸桿菌DH5a購自天根生化科技北京有限公司；A-Tailing Kit，pBack-Zero-T載體、DNA相對分子質量標準均為TaKaRa公司產(chǎn)品；pCas-Guide載體購自Origen公司；質粒小提試劑盒為Promega公司產(chǎn)品；脂質體轉染試劑Li-pofectAMINE 2000購白Invitrogen公司；限制性內(nèi)切酶BamH I、T4 DNA連接酶均為Fermentas公司產(chǎn)品；ECL化學發(fā)光試劑、限制性內(nèi)切酶BsmB I為Thermo Scientific公司產(chǎn)品；蛋白相對分子質量標準購自北京凱諾春天生物科技有限公司；KOD-Plus-Neo為TOYOBO公司產(chǎn)品；anti—DDDDK-Tag為MBL公司產(chǎn)品；Ku70抗體為Santa Cruz Biotechnology公司產(chǎn)品；3-actin抗體為Proteintech公司產(chǎn)品；辣根過氧化酶標記的山羊抗小鼠lgG購自北京中杉金橋生物技術有限公司；胎牛血清購白康源生物技術有限公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒、細胞基因組DNA提取試劑盒購自北京百靈克生物科技有限公司；anti-Flag M2 Afficity Gel為Sigma公司產(chǎn)品；RIPA裂解液、瓊脂糖珠洗滌緩沖液(Tris-HCl 50 ymol/L．pH7.5；NaCI 150ll,mol/L)均為實驗室配制；引物(表1)由Invitrogen公司合成。
1.2 構建pCas-XRCC6載體
在Blue Heron網(wǎng)站(http://wwws.f)lueheronbio.Com/external/tools/gRNA Src.j sp．)設計長度為20 bp的gRNA序列，本實驗選擇了3條gRNA序列（表1）。將3條gRNA序列兩端分別添加BamH I和BsmB I酶切位點，94。C退火5 min形成dsDNA，室溫放置30 min，用T4DNA連接酶將BamH I和BsnzB I酶切回收后的pCas- Guide載體和退火后的dsDNA片段連接，得到載體pCas-XRCC6Ul、pCas-XRCC6U2和pCas-XRCC6U3，將上述連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌DH50感受態(tài)細胞，涂布于含有氨芐西林(Amp)的LB瓊脂糖平板上，37。C孵育過夜，挑菌培養(yǎng)，提取質粒，送天一輝遠公司測序。
1.3 構建供體DNA載體
根據(jù)GenBank中XRCC6基因序列設計引物，以HeLa細胞基因組為模板，以Flaglf和Flag2r為引物擴增左同源臂片段Al，以Flag3f和FJag4r為引物擴增右同源臂片段A2（PCR條件：94C2 min; 94C15 s．52。C 30 s，68Cl min，行35個循環(huán)；680C10 min．25℃2 min)。瓊脂糖凝膠電泳試劑盒回收目的條帶。以片段Al、A2共同作為模板，以Flaglf和Flag4r為引物，PCR擴增得到供體DNA片段B，用A-Tailing Kit在DNA片段B的末端加上單個堿基A，并將該片段克隆到pBackZero—T載體上，挑取單克隆，以引物Flaglf和pBackZero-T載體下游鑒定引物BlaRV(5'- ACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCA-3)進行菌落PCR鑒定，提取質粒測序。
1.4細胞轉染及穩(wěn)定株的篩選與鑒定
將上述構建的3個pCas-XRCC6載體（1ug）分別和pXRCC6-Donor載體(1.5 Vg)共轉染HeLa細胞（轉染試劑LipofectAMINE 2000），轉染后第8d（約傳代2—3次）收取細胞，在蛋白水平檢測3個pCas-XRCC6載體分別和pXRCC6- Donor載體共轉染HeLa細胞后，F(xiàn)lag標簽序列插入XRCC6基因的效率。將共轉染后Flag標簽序列插入效率最高的HeLa細胞接種到含有20 mL DMEM（含10%胎牛血清）的細胞培養(yǎng)吼(15 cm)中（lXl03/皿），每隔4d換一次細胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)10 d后，挑取單克隆細胞接種于96孔板中繼續(xù)培養(yǎng)。待細胞傳代于6孔板中時，取1/10保種，剩余細胞裂解，Western印跡鑒定Flag標簽序列是否插入XRCC6基因并表達。取少量在蛋白水平鑒定成功的XRCC6- Flag穩(wěn)定表達細胞株，提取基因組DNA，以Flag和Flag4r為引物行PCR擴增，在基因組水平驗證Flag標簽插入XRCC6基因5 ’端。
1.5 免疫共沉淀
將篩選出的XRCC6- Flag穩(wěn)定表達細胞株繼續(xù)培養(yǎng)至一大培養(yǎng)瓶，長滿時收取細胞，加500 VLRIPA裂解液（450LL RIPA+50 VL蛋白酶抑制劑），超聲波破碎細胞，4℃、12 000 r/min離心10min；將帶有Flag標簽抗體的瓊脂糖珠(anti- FlagM2 Afficity Gel)用1 mL預冷的洗脫緩沖液洗滌3次，將瓊脂糖珠加入細胞裂解液中，4℃緩慢搖動過夜，次日于4℃、3000 r/min離心1 min，收集瓊脂糖珠與目的蛋白復合物，用預冷的洗脫緩沖液洗滌3次，1mL/次；用30 VL 2x上樣緩沖液將瓊脂糖珠輕輕懸起，煮樣，Western印跡檢測。
2 結果
2.1 構建pCas-XRCC6載體和pXRCC6-Donor載體
利用Blue Heron網(wǎng)站軟件對XRCC6基因終止密碼兩側約60 bp的序列進行分析，設計gRNA序列，選出3條gRNA（表1），分別連接到pCas- Guide載體（圖1），構建pCas-XRCC6Ul、pCas-XRCC6U2．pCas-XRCC6U3載體，分別轉化大腸桿菌，提取質粒測序，測序結果與設計一致。
根據(jù)GenBank中XRCC6基因序列設計同源臂序列并合成其擴增引物，以HeLa細胞基因組DNA為模板，PCR擴增得到500～600 bp的2條同源臂A1、A2（圖2）。以同源臂A1、A2共同作為模板，以Flaglf和Flag4r為引物進行搭橋PCR擴增，得到約1100 bp的DNA片段B（圖2）。片段B末端加堿基A后連接pBackZero-T載體，構建pXRCC6-Donor載體（圖3）。以Flaglf和BlaRV為引物進行菌落PCR鑒定，經(jīng)鑒定在1200 bp處有目的條帶（圖2），提取質粒測序，結果顯示編輯XRCC6基因的供體DNA載體構建成功。
2.2穩(wěn)定細胞株XRCC6-Flag篩選與鑒定
轉染后第8d收集細胞提取蛋白質，Western印跡檢測Flag標簽序列插入XRCC6基因5 ’端的效率。圖4顯示，gRNAU2位點的Flag標簽序列插入XRCC6基因的效率最低，gRNAU3位點的Flag標簽序列插入XRCC6基因的效率最高。因此，選取pCas-XRCC6U3載體和供體DNA載體共轉染HeLa細胞進行穩(wěn)定株的篩選。
將pCas-XRCC6U3載體和pXRCC6-Donor載體共轉染HeLa細胞10 d后，挑取單克隆于96孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞傳代至6孔板中并長滿時，Western印跡鑒定在蛋白水平上Flag標簽序列是否插入XRCC6基因5 ’端，以p53-Flag質粒過表達的HeLa細胞全細胞裂解液為陽性對照。Western印跡結果(圖5)顯示，72號細胞株在相對分子質量約70xi03處有條帶，即該細胞株為XRCC6- Flag穩(wěn)定表達細胞株。鑒定100株細胞，共獲得3株XRCC6- Flag穩(wěn)定表達的細胞株。
為了進一步確定該細胞株為XRCC6-Flag穩(wěn)定表達細胞株，分別提取該3株細胞株的基因組DNA作為模板，以Flag和Flag4r為引物檢測Flag標簽序列是否插入XRCC6基因5 ’端。PCR擴增得到約600 bp條帶（圖6），進一步證明Flag標簽序列已插入XRCC6基因5 ’端。
2.3穩(wěn)定細胞株XRCC6-Flag免疫共沉淀分析
制備HeLa細胞裂解液，用XRCC6( Ku70)抗體沉淀XRCC6蛋白，Western印跡檢測結果表明免疫共沉淀后的全細胞裂解液上清液中仍有較多XRCC6蛋白殘留（圖7）。制備篩選獲得的XRCC6-Flag穩(wěn)定表達細胞株的全細胞裂解液，用anti-DDDDK- Tag (Flag tag)抗體進行免疫共沉淀XRCC6-Flag蛋白，Western印跡檢測結果顯示免疫共沉淀后的全細胞裂解液上清液中幾乎沒有殘余目的蛋白（圖7）。結果表明利用Flag標簽抗體的特異性可以實現(xiàn)對XRCC6-Flag穩(wěn)定表達細胞株中Ku70蛋白更好的沉淀，效率遠遠高于用Ku70抗體免疫共沉淀內(nèi)源的XRCC6蛋白。
3討論
XRCC6蛋白(Ku70)參與非末端同源重組修復，與Ku80蛋白形成二聚體，結合到損傷斷裂的DNA末端，參與DNA損傷修復。Ku70/Ku80復合體不僅在維持基因組完整性中起重要作用，在DNA復制、細胞凋亡、端粒結構的維持和基因轉錄調控中期也有重要作用。此外，Ku70還是一個腫瘤抑制因子，但是其作用機制尚不明確。
我們利用CRISPR/Cas系統(tǒng)對XRCC6基因5 ’端進行編輯，gRNA與靶序列結合，引導Cas9核酸內(nèi)切酶將XRCC6基因5 ’端的雙鏈DNA斷裂，轉染進入細胞的供體DNA序列提供修復模板，細胞利用同源重組修復方式將斷裂位點修復，從而將Flag標簽序列插入XRCC6基因5 ’端。免疫共沉淀結果顯示，anti-DDDDK-Tag抗體的沉淀效果比Ku70抗體的沉淀效果好。因此，在研究某些不常見蛋白或抗體效率低的蛋白時，利用在基因組中插入標簽的方法，可以解決抗體效率低的問題。而且Flag標簽蛋白由24個堿基編碼而成，分子很小，在Ku70蛋白后加Flag標簽不會影響Ku70蛋白的功能。在大規(guī)模篩選前，針對不同DNA序列位點構建的載體，在轉染細胞后于蛋白水平進行初步檢測，根據(jù)Western印跡結果，選擇插入效率較高的位點載體進行穩(wěn)定細胞株的篩選，可以減少工作量，提高效率。除了在蛋白表達水平進行鑒定外，對在蛋白水平鑒定出的XRCC6-Flag穩(wěn)定細胞株提取基因組DNA，以Flag和Flag4r為引物進行PCR擴增，在蛋白水平和基因組水平上雙重驗證了Flag標簽已插入XRCC6基因組。XRCC6-FLag穩(wěn)定表達細胞株的獲得，為深入研究XRCC6基因及其蛋白的生物學功能提供了有效細胞模型。
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