正丁醇沉淀法分離小麥淀粉的研究
劉樹興，楊麒，趙廣蒙
陜西科技大學食品與生物工程學院(西安710021)
摘要 采用正丁醇反復沉淀法，對小麥淀粉中的直鏈淀粉和支鏈淀粉進行多次反復離心純化，實現(xiàn)二者的分離。通過雙波長法，測定了原淀粉中直鏈和支鏈淀粉的比例。測定了最終得到的直鏈和支鏈淀粉的藍值，結果均在標準范圍內。重點測定了分離次數(shù)與純度的關系，分離次數(shù)分別達到7次、10次后，直鏈和支鏈淀粉的純度可以達到98%。結果顯示，該方法用于實驗室分離小麥直鏈淀粉與支鏈淀粉效果顯著。
關鍵詞 直鏈淀粉；支鏈淀粉；分離；藍值：雙波長分光光度法
淀粉是一種可再生、可生物降解的天然高分子物質，在可持續(xù)發(fā)展意識不斷增強的今天，其不僅在食品工業(yè)中起著決定性的作用，在材料、生物及醫(yī)藥等領域的應用也日益引人注目。直鏈淀粉和支鏈淀粉是淀粉的兩大主要組分，由于二者的分子結構、分子聚集狀態(tài)各異，從而使得不同來源的淀粉有各自的應用表現(xiàn)。同時，直鏈淀粉和支鏈淀粉本身也有著不同的性能和用途，比如直鏈淀粉具有良好的成模性、質構調整、凝膠性及促進營養(yǎng)素吸收等功能，而支鏈淀粉具有抗老化特性、改善凍融穩(wěn)定性、增稠作用等功能。為了拓展直鏈和支鏈淀粉各自特性的有價應用，必須對直鏈、支鏈淀粉進行有效分離。
采用雙波長法，對原小麥淀粉中的直鏈和支鏈淀粉的比例進行了確定。因為直、支鏈淀粉一碘復合物的吸收峰重疊，因此不能消除樣品溶液中同時存在的支鏈淀粉與碘形成的紫紅色復合物及其他背景的吸收，所以結果的準確性依賴于直、支鏈淀粉含量和比例、鏈長組成及其分布。雙波長法可以同時測定直、支鏈淀粉的含量，進而計算總淀粉含量，對于研究直、支鏈淀粉非常有用。
使用丁醇沉淀法分離直鏈淀粉和支鏈淀粉，人們已經(jīng)進行了有關研究。曾凡逵，李彬，吳平等分別對馬鈴薯淀粉、玉米淀粉、錐栗淀粉采用該方法進行了直鏈、支鏈淀粉的分離，結果顯示效果都比較好。對直鏈、支鏈淀粉分離次數(shù)及效果的研究并不多，因此著重進行分析討論，以促進我國直鏈、支鏈淀粉的深入研究以及淀粉工業(yè)的蓬勃發(fā)展。同時為后續(xù)“直鏈淀粉含量抗性淀粉得率的影響”試驗做前期準備。
1 材料與方法
1.1材料與試劑
小麥淀粉：陜西大河粉業(yè)有限公司；標準直鏈淀粉、標準支鏈淀粉：美國Sigma公司；氫氧化鈉（分析純）、氫氧化鉀（分析純）：天津市科密歐化學試劑有限公司；鹽酸（分析純）、無水乙醇（分析純）、正丁醇（分析純）、異戊醇（分析純）：天津市天力化學試劑有限公司；碘化鉀（分析純）、碘（分析純）：天津市東麗區(qū)天大化學試劑廠。
1.2主要儀器與設備
UV-2600紫外分光光度計：尤尼柯（上海）儀器有限公司；SC-3610離心機：安徽中科中佳科學儀器有限公司；DZF真空干燥箱：北京科偉永興儀器有限公司；電子天平BS 324S萬分：賽多利斯儀器有限公司；旋轉蒸發(fā)儀RE 52A:上海亞榮升華儀器廠。
1.3試驗方法
1.3.1小麥原淀粉水分含量測定
采用GB 5009.3-2010中的直接干燥法，精密稱量后，置101℃～105℃ 干燥箱中，瓶蓋斜支于瓶邊，干燥2～4 h后，蓋好取出，放入干燥器內冷卻0.5 h后稱量。然后再放入101℃～105℃干燥箱中干燥1h左右，取出，放入干燥器內冷卻0.5 h后再稱量。并重復以上操作至前后兩次質量差不超過2 mg，即為恒重。
試樣中的水分的含量按式(1）進行計算。
X =(m1-m2)／(m3-m4)×100% (1)
式中：X-----試樣中水分的含量，g/100 g；m1——稱量瓶（加海砂、玻棒）和試樣的質量，g；m2——稱量瓶（加海砂、玻棒）和試樣干燥后的質量，g；m3——稱量瓶（加海砂、玻棒）的質量，g；m4——稱量瓶（加海砂、玻棒）干燥后的質量，g。
水分含量≥1 g/100 g時，計算結果保留三位有效數(shù)字；水分含量<1 g/100 g時，結果保留兩位有效數(shù)字：
1.3.2原淀粉中直鏈淀粉與支鏈淀粉的比例的確定
早期的測定多采用單波長法，事實上單波長法測定的是直鏈淀粉，因為只有直鏈淀粉與碘形成藍色，而支鏈淀粉與碘的結合能力很弱，而且顏色呈紫紅色。因為直、支鏈淀粉-碘復合物的吸收峰重疊，因此不能消除樣品溶液中同時存在的支鏈淀粉與碘形成的紫紅色復合物及其他背景的吸收。雙波長法可以同時測定直、支鏈淀粉的含量，進而計算總淀粉含量。
1.3.2.1淀粉標準溶液配制
稱取50.0 mg標準直鏈淀粉，放入100 m L容量瓶中，加入1 mol/L NaOH溶液5 m L，在熱水中溶解后，取出，用蒸餾水定容至100 m L，混勻，即為0.5 mg/m L直鏈淀粉標準溶液。取標準溶液0，0.1，0.3，0.5，0.7，0.9，1.1和1.3 m L分別置于25 m L比色管中，加15m L H2O以0.1 mol/L HC1調pH至3.5，加0.5 m碘試劑，定容，混勻，即得濃度為0，2，6，10，14，18，22和26 μg/m L的直鏈淀粉標準溶液系列。
同樣方法制備支鏈淀粉標準溶液，考慮實際樣品中支鏈淀粉的含量較高，因此配制標準溶液系列對分別取0.5 mg/m L支鏈淀粉溶液0，1，2，3，4和5m L，得到0，20，40，60，80和100 μg/m L的標準溶液系列。
1.3.2.2確定測定波長與參比波長
各選一適宜濃度的直鏈淀粉（20 μg/m L）和支鏈淀粉（60 μg/m L）標準溶液，分別在紫外一可見分光光度計上進行400～900 nm光譜掃描，將吸收曲線疊加繪制在同一個坐標系中。最大吸收波長為各自的測定波長；通過作圖法分別得到各自的參比波長。
1.3.2.3雙波長標準曲線的繪制
將所配制的直鏈淀粉系列標準溶液分別在測定波長和參比波長處測定吸光度，以蒸餾水作空白，以濃度C為橫坐標，以吸光度差值
為縱坐標作直鏈淀粉標準曲線，并計算回歸方程。
同法做出支鏈淀粉的標準曲線和回歸方程。
1.3.2.4含量計算
根據(jù)所得直鏈淀粉與支鏈淀粉雙波長標準曲線，計算原淀粉中直鏈淀粉與支鏈淀粉比例。
1.3.3直鏈淀粉與支鏈淀粉的分離與純化
1．3.3．直鏈淀粉與支鏈淀粉的粗分離
準確稱取10 g干燥后的小麥淀粉，加入少量無水乙醇分散并濕潤樣品，再加入350 m L 0.5 mol/L的氫氧化鈉，在沸水浴中攪拌20 min，使溶液清澈透明，無結團狀，冷卻后離心3 500 r/min 20 min，用2rnol/L的鹽酸中和至中性，加入100 m L正丁醇-異戊醇(3：1)混合液，在沸水浴中加熱攪拌10 min后，冷卻至室溫，于2℃~4℃的冰箱中靜置48 h，取出，離心3 500 r/min 20 min，得到的沉淀物為粗直鏈淀粉，離心液為粗支鏈淀粉。
1.3.3.2直鏈淀粉的純化
將粗直鏈淀粉沉淀全部移人正丁醇飽和的200 m L水中，加熱溶解至溶液透明，冷卻至室溫后放入2℃~4℃的冰箱中靜置24 h，取出離心3 500 r/min，20min，將所得沉淀物按上述步驟重復操作10次（即重結晶10次），將沉淀物用無水乙醇洗滌數(shù)次后，真空干燥，即得純化的直鏈淀粉樣品。
每次純化后取樣少許，洗滌干燥后置于干燥器，便于之后測定每次純化后的含量。
1.3.3.3支鏈淀粉的純化
將2.2.1中的粗支鏈淀粉上清液置于分液漏斗中靜置，取下層加入40 m L正丁醇-異戊醇(3：1)混合液，在沸水浴中加熱攪拌至溶液分散透明，冷卻至室溫，移人2℃～4℃冰箱中靜置48 h，離心3 500 r/min，20 min去除沉淀，用上清液重復上述操作10次（即重結晶10次）。將最終上清液加入2倍體積的無水乙醇沉淀，低溫靜置24 h后離心，將沉淀溶于熱的200 m L0.5 mol/L的NaOH溶液中，離心去沉淀，中和。離心液中再加2倍體積的無水乙醇，將沉淀溶于200 m L蒸餾水中，用2倍體積的無水乙醇再沉淀，以無水乙醇洗滌數(shù)次，真空干燥得到純化的支鏈淀粉樣品。
同樣每次純化后取樣，洗滌干燥后置于干燥器。
1.3.4分離后，直鏈、支鏈淀粉藍值的測定
藍值是表示淀粉結合碘能力的一個指標，直鏈淀粉由于其線性聚合度很高，6個葡萄糖分子就可以結合1個碘，藍值很大，一般為0.8～1.2。支鏈淀粉的側鏈鏈長只有14～30葡萄糖殘基，與碘結合能力很弱，故藍值較小，在0.08～0.22。測定方法采用Gibert和Spragg法。然后按式(2)計算：
藍值=A680×4／樣品的濃度(mg/d L) (2)
1.3.5直鏈、支鏈淀粉含量測定
1.3.5.1標準曲線制作
將2.2中所配制的直鏈、支鏈淀粉系列標準溶液分別在各自最大吸收波長處測定吸光度，以濃度C為橫坐標，以吸光度A為縱坐標，分別得到直鏈淀粉標準曲線與支鏈淀粉標準曲線，并計算回歸方程。
1.3.5.2含量計算
根據(jù)所得直鏈淀粉與支鏈淀粉標準曲線，計算每次純化后取樣的直鏈淀粉與支鏈淀粉含量。
2結果與分析
2.1原淀粉含水量
經(jīng)直接干燥法，測得原淀粉含水量為13.2%。
2.2原淀粉中直鏈淀粉與支鏈淀粉比例
圖1為直鏈、支鏈淀粉分別于碘結合后的顏色，圖2為直鏈淀粉(20 μg/L)和支鏈淀粉(60μg /m L)標準溶液碘吸收光譜掃描圖�？梢娦←溨辨湹矸�-碘與支鏈淀粉-碘吸收曲線存在明顯的差異，說明二者與碘結合能力、結構存在較大差異。用作圖法（圖中虛線所示），可以得到直鏈淀粉與支鏈淀粉最大吸收波長分別為635和533 nm，參比波長分別為740和668 nm。
圖3顯示，直鏈、支鏈淀粉的雙波長標準曲線線性關系良好。經(jīng)計算，得出小麥原淀粉中：直鏈淀粉含量為27.74%，支鏈淀粉含量為71.15%，原淀粉純度為98.89%。
2.3鏈淀粉、支鏈淀粉分離過程
直鏈淀粉與支鏈淀粉各經(jīng)過10次純化干燥后，得到純化直鏈淀粉與支鏈淀粉拍攝照片見圖4。
從圖4可以看出，制得的小麥直鏈淀粉經(jīng)干燥后，邊緣不規(guī)則，呈棉絮形。支鏈淀粉經(jīng)干燥后，呈蠟質狀。
最終得到直鏈淀粉和支鏈淀粉分別為1.98 g和4.24 g，二者得率分別為19.8%和42.4%(原料為10.00g)。直鏈淀粉和支鏈淀粉的損失主要來自于進一步分離直鏈淀粉中的支鏈淀粉，和支鏈淀粉中的直鏈淀粉，另外與分離次數(shù)也有一定關系。并且可以看出在分離過程中，支鏈淀粉損失更大。
2.4藍值
測得最終分離得到的小麥直鏈淀粉和支鏈淀粉的藍值為分別為1.08和0.15，均處于相應的分布范圍內，表明純化后的小麥直鏈淀粉和支鏈淀粉的純度較高。
2.5直鏈淀粉與支鏈淀粉含量測定
圖5為直鏈淀粉最大吸收波長( 635 nm)處作出的標準曲線，據(jù)此測得直鏈淀粉每次純化后其含量，如圖6所示。可以看出直鏈淀粉純化中，5次純化之后其含量趨于平緩，7次純化后純度可以達到98.21%。
圖7為支鏈淀粉最大吸收波長( 533 nm)處作出的標準曲線，據(jù)此測得支鏈淀粉每次純化后其含量，如圖8所示�？梢钥闯鲋ф湹矸奂兓校�6次純化之后其含量趨于平緩，10次純化后純度可以達到98.25%。
3結論
1)小麥原淀粉中，直鏈淀粉含量為27.74%，支鏈淀粉含量為71.15%。
2)得到直鏈淀粉和支鏈淀粉的藍值為1.08和0.15，二者得率分別為19.8%和42.4%。
3)直鏈、支鏈淀粉在分離第6次之后效果趨于平緩，分離7次、10次后，純度可以達到98%。
4)實驗室中用丁醇沉淀法，在離心轉速為3 500r/min，離心時間20 min的分離條件下，可以得到純度很高的直鏈淀粉和支鏈淀粉。
下一篇:返回列表
