關(guān)于 酶一酸水解法制備水溶性珍珠粉的探索
相關(guān)鏈接： 中國(guó)安全網(wǎng) 中國(guó)質(zhì)量網(wǎng) 中國(guó)論文網(wǎng) 中國(guó)資訊網(wǎng)
作者：張毅
水溶性珍珠粉一般是使用酸或者酶對(duì)珍珠粉進(jìn)行處理，將其不溶成分碳酸鈣和角質(zhì)蛋白變成可溶于水且90%以上能被人體直接吸收利用的活性鈣、游離氨基酸和微量元素。水溶性珍珠粉因其大部分營(yíng)養(yǎng)成分都能被人體直接吸收，多用于內(nèi)服治療保健，通過(guò)調(diào)節(jié)人體內(nèi)分泌，促進(jìn)新陳代謝和增強(qiáng)機(jī)體免疫力，預(yù)防心血管疾病，改善心臟功能以及抑制癌細(xì)胞增生等。有關(guān)水溶性珍珠粉的合適加工工藝、分子質(zhì)量分布以及抗氧化活性鮮見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。試驗(yàn)對(duì)水溶性珍珠粉加工的主要工藝參數(shù)優(yōu)化，且測(cè)定其產(chǎn)物分子質(zhì)量分布和清除超氧陰離子自由基能力，為定向制備功能性珍珠肽產(chǎn)品以及抗氧化活性研究提供有益的參考和借鑒。
1 材料與方法
1.1材料與試劑
珍珠粉：湖南今珠生物有限公司提供；中性蛋白酶（酶活力10萬(wàn)U/g）：廣西龐博生物工程有限公司。
1.2儀器與設(shè)備
Waters 600高效液相色譜儀：美國(guó)沃特斯公司；UVmini-1240紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：島津制作所。
1.3主要試驗(yàn)流程
稱取1.5 g珍珠粉放人錐形瓶一加蒸餾水至30mL->煮沸->降溫->加入->定量中性蛋白酶->反應(yīng)->段時(shí)間->加入->定量中性蛋白酶->反應(yīng)->段時(shí)間->升溫至90℃加入->定量乳酸煮沸->保溫2 h (95℃—100℃)
1.4工藝參數(shù)優(yōu)化單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)
1.4.1 乳酸用量對(duì)珍珠粉水解度的影響
乳酸用量分別為：1.5，2，2.5，3和3.5 L。
取5個(gè)錐形瓶（分別標(biāo)記1，2，3，4和5）->1.5g珍珠粉加蒸餾水至30 m L->降溫至37℃，加入0.2 g中性蛋白酶斗反應(yīng)3 h，加入0.1 g中性蛋白酶->反應(yīng)3h，升溫至90℃->分別加1.5，2，2.5，3和3.5 L乳酸->煮沸，保溫2 h
1.4.2加酶量（分2次添加）對(duì)珍珠粉水解度的影響
第一次加酶量：0.14，0.17，0.20，0.23和0.26g；第二次加酶量：0.04，0.07，0.10，0.13和0.16 g。
取5個(gè)錐形瓶（分別標(biāo)記1，2，3，4和5）-y1.5 g珍珠粉加蒸餾水至30 m L->降溫至37℃，分別加中性蛋白酶0.14，0.17，0.20，0.23和0.26->反應(yīng)3h，分別加中性蛋白酶0.04，0.07，0.10，0.13和0.16 g-反應(yīng)3h，升溫至90℃->加3 m L乳酸->煮沸，保溫2 h
1.4.3酶解時(shí)間對(duì)珍珠粉水解度的影響
第一次酶解時(shí)間：140，160，180，200和220min；第二次酶解時(shí)間：140，160，180，200和220min。
取5個(gè)錐形瓶（分別標(biāo)記1，2，3，4和5）-+1.5 g珍珠粉加蒸餾水至30 m L降溫至37℃，加0.23 g中性蛋白酶->分別反應(yīng)140，160，180，200和220 min->加0.13 g中性蛋白酶->分別反應(yīng)140，160，180，200和220 min-升溫至90℃->加3 m L乳酸->煮沸，保溫2 h
1.4.4酶解溫度對(duì)珍珠粉水解度的影響
溫度設(shè)置：30℃，35℃，40℃，45℃和50℃。
取5個(gè)錐形瓶（分別標(biāo)記1，2，3，4和5）->1.5 g珍珠粉加蒸餾水至30 m L->分別控溫至30℃，35℃，40℃，45℃ 和50℃->加0.23 g中性蛋白酶->反應(yīng)200min->加0.13 g中性蛋白酶->反應(yīng)200 min，升溫至90℃->加3mL乳酸->煮沸，保溫2h
1.5珍珠水解液pH的測(cè)定
用pH測(cè)試儀測(cè)定珍珠水解液pH，確保珍珠粉在適宜的酸度環(huán)境下正常酸解。
1.6游離氨基氮的測(cè)定
樣品濾液2 m L于錐形瓶中->蒸餾水4 m L->3滴酚酞指示劑，搖勻->氫氧化鈉溶液滴定至微紅色->中性甲醛溶液2 m L，搖勻，放置片刻->0.003 75 mol/L氫氧化鈉溶液滴定至微紅色終點(diǎn)
氨基氮含量的計(jì)算如公式(1)所示。
式中：V1-------樣品加甲醛后消耗的氫氧化鈉體積，m L; V2——空白加甲醛后消耗的氫氧化鈉體積，M L; c-------氫氧化鈉濃度，mol/L; m-------樣品質(zhì)量，g。
1.7分子質(zhì)量分布的測(cè)定
取水解前后的珍珠粉樣品進(jìn)行分子質(zhì)量分布測(cè)定。樣品制備：樣品溶解于流動(dòng)相，高速離心(8 000r/min，10 min)，用0.45 um微孔濾膜過(guò)濾后供進(jìn)樣。液相色譜條件：色譜柱UltrahydrogelrM Linear 300mm×7.8 mm；流動(dòng)相0.1 mol/L NaNO3；流速0.9 m L/min；柱溫45℃；分子質(zhì)量校正曲線所用標(biāo)準(zhǔn)品：MW2000000、MW133 800、MW7100、MW2500和
MW180。分子質(zhì)量計(jì)算如公式(2)。
式中：Mw——分子質(zhì)量，D a；T-洗脫時(shí)間，min。
1.8清除超氧陰離子自由基能力測(cè)定
取酸酶水解前后的珍珠粉樣品測(cè)定其清除超氧陰離子自由基，測(cè)定方法參考文獻(xiàn)。
取4.5 m L 0.05 mol/L Tris緩沖溶液(pH 8.2)于試管中一加待測(cè)溶液1.0 m L->加蒸餾水3.0 m L->混勻，放入25℃水浴鍋中保溫20 min->取出后立即加入25℃水浴過(guò)的0.05 mol鄰苯三酚0.5 m L->混勻后立即倒人比色皿中->于420 nm處每隔30 s測(cè)值一次，共測(cè)5 min
自由基清除率的計(jì)算方法如公式(3)。
式中：F r——對(duì)照溶液吸光度隨時(shí)間的變化率，%；F x——待測(cè)樣品吸光度隨時(shí)間的變化率，%。
2結(jié)果與討論
2.1 乳酸用量對(duì)珍珠粉水解度的影響
乳酸用量對(duì)珍珠粉水解度的影響如表1所示。隨著乳酸用量的增加，氨基酸氮的含量逐漸增加，當(dāng)乳酸用量為3 m L，珍珠粉水解最充分，氨基氮含量最高。原因可能是乳酸用量較少，無(wú)法對(duì)酶解后游離的蛋白質(zhì)進(jìn)一步充分酸解，那么溶液中分子質(zhì)量較小的水溶性蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸等的含量也相應(yīng)減少，從而影響氨基氮的含量。
比較研究了水溶性珍珠粉不同制備工藝，結(jié)果表明酶酸水解法相比酸酶水解法和乳酸水解法對(duì)珍珠粉的水解更加充分，1g珍珠粉的乳酸用量為2.15 m L．而試驗(yàn)1.5 g珍珠粉乳酸用量為3 m L，水解珍珠粉的乳酸用量基本上一致。
2.2加酶量對(duì)珍珠粉水解度的影響
加酶量對(duì)珍珠粉水解度的影響結(jié)果如表2所示。2次加酶量分別為0.23 g，0.13 g，珍珠粉水解最充分，氨基氮含量最高，且測(cè)定水解液pH 5.3，處于正常pH5~6之內(nèi)，對(duì)珍珠液的酶解沒(méi)有明顯的影響。分析比較水平4和水平5，加酶量不同，但其氨基氮含量差異非常小，其原因是加酶量達(dá)到最佳值，水解完全，如果酶的用量過(guò)大，一方面不經(jīng)濟(jì)，另一方面也給后續(xù)處理帶來(lái)不便。制備淡水珍珠水解液用胰蛋白酶，而試驗(yàn)用中性蛋白酶，這也導(dǎo)致酶的用量存在差異。
2.3酶解時(shí)間對(duì)珍珠粉水解度的影響
酶解時(shí)間對(duì)珍珠粉水解度的影響如表3所示，反應(yīng)200 min，珍珠粉的水解最充分，氨基氮含量最高。推測(cè)原因可能是如果酶解時(shí)間不充足，珍珠粉中的角蛋白和碳酸鈣等水解不充分，從而影響最終氨基氮的含量。
用正交試驗(yàn)法摸索水解珍珠的最佳工藝，研究表明最佳水解時(shí)間為24 h�？赡苁且�?yàn)槠渌?
解珍珠的制備工藝是酸水解法，而試驗(yàn)用的是酶酸水解法。淡水珍珠水解液的制備的最佳水解時(shí)間為6h，而試驗(yàn)最佳水解時(shí)間為6 h 40 min，水解時(shí)間存在一致性。
2.4酶解溫度對(duì)珍珠粉水解度的影響
酶解溫度對(duì)珍珠粉水解度的影響如表4所示，反應(yīng)溫度40℃，珍珠液水解最充分，氨基氮含量最高。試驗(yàn)中，酶解溫度40℃，條件溫和，不會(huì)引起蛋白質(zhì)變性損失，而物理研磨處理過(guò)程中的高熱和化學(xué)分解處理中添加的化學(xué)試劑都會(huì)不同程度的引起大量蛋白質(zhì)損失。
通過(guò)單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)得出水溶性珍珠粉最佳水解條件為：珍珠粉用量1.5 g，酶解溫度40℃，中性蛋白酶的第一次加入量0.23 g，酶解時(shí)間3 h 20 min，中性蛋白酶第二次加入量0.13 g，酶解時(shí)間3 h 20 min，酶解結(jié)束后，溫度升高到90℃，加入3 m L乳酸，煮沸保溫2h（溫度為95℃—100℃），制備的水溶性珍珠粉氨基氮含量為10.13%。
2.5分子質(zhì)量分布檢測(cè)結(jié)果與分析
2.5.1未水解珍珠粉分子質(zhì)量的分布
未水解珍珠粉分子質(zhì)量分布的高效液相色譜圖如圖1所示，未水解珍珠粉分子質(zhì)量的分布不明顯，無(wú)明顯波峰。推測(cè)可能是珍珠粉中的主要成分是硬蛋白和大量的碳酸鈣不溶于水，無(wú)法檢測(cè)出分子質(zhì)量的分布。
2.5.2水解后珍珠粉分子質(zhì)量的分布
水解后珍珠粉分子質(zhì)量分布結(jié)果如圖2所示，結(jié)合表5，質(zhì)量含量為82.50%的水溶性珍珠粉分子質(zhì)量主要分布為61～71 D a。由于珍珠粉水解后，主要成分是乳酸鈣，所占比例較大。水解后的產(chǎn)品含有其它分子質(zhì)量分布的物質(zhì)，分子質(zhì)量分布較為廣泛，因此更有利于人體的吸收利用。
2.6未水解珍珠粉和水解后珍珠粉清除超氧陰離子能力的比較
2.6.1蒸餾水、未水解珍珠粉和水解珍珠粉的吸光度隨時(shí)間的變化
如圖3所示，蒸餾水吸光度隨時(shí)間的增加而增加，未水解珍珠粉和水解珍珠粉的吸光度隨時(shí)間的增加而降低。
2.6.2珍珠粉清除超氧陰離子能力的比較
水解后的珍珠粉自由基清除率，結(jié)果如表6所示，水解后的珍珠粉吸光度隨時(shí)間的變化率為1.83×10-3%，清除超氧陰離子能力為15.07%。推測(cè)得出水溶性珍珠粉的抗氧化活性較為穩(wěn)定，與未水解的珍珠粉相比較，清除超氧陰離子的能力有所提高。
3結(jié)論
試驗(yàn)對(duì)水溶性珍珠粉的制備工藝、分子質(zhì)量分布、抗氧化活性等作了研究與探討，主要結(jié)論歸納如下：最佳水解條件為：珍珠粉用量1.5 g，酶解溫度40℃，中性蛋白酶的第一次加入量0.23 g，酶解時(shí)間3 h 20 min，中性蛋白酶第二次加入量為0.13 g，酶解時(shí)間3 h 20 min．酶解結(jié)束后，溫度升高到90℃，加入3 m L乳酸，煮沸保溫2h(溫度控制在95℃～100℃)的條件下，制備出的水溶性珍珠粉氨基氮含量為10.13%；質(zhì)量分?jǐn)?shù)82.50%的水溶性珍珠粉分子質(zhì)量分布范圍為61～71 D a;水溶性珍珠粉吸光度隨時(shí)間的變化率為1.83×10-3%，超氧陰離子清除率為15.07%，水溶性珍珠粉抗氧化性能不顯著，但抗氧化性能穩(wěn)定。
4摘要 研究采用中性蛋白酶、乳酸水解珍珠粉，以水解度為指標(biāo)，對(duì)加酶量、酶解溫度、酶解時(shí)間、乳酸用量進(jìn)行工藝參數(shù)優(yōu)化制備水溶性珍珠粉，并測(cè)定其分子質(zhì)量分布和清除超氧陰離子自由基能力。結(jié)果表明，最佳水解條件：珍珠粉用量1.5 g，酶解溫度40℃，中性蛋白酶第一次加入量0.23 g，酶解時(shí)間3 h 20 min，中性蛋白酶第二次加入量0.13 g，酶解時(shí)間3 h 20 min，然后溫度升高到90℃，加入3 m L乳酸，煮沸保溫2h(溫度95 ℃～100 ℃)，制備的水溶性珍珠粉氨基氮含量為10.13%。質(zhì)量分?jǐn)?shù)為82.5%的水溶性珍珠粉分子質(zhì)量分布范圍為61～71 D a，清除超氧陰離子自由基能力為15.07%。
