關(guān)于 冠突散囊茵液體發(fā)酵產(chǎn)色素理化性質(zhì)的探索
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作者；張毅
冠突散囊菌是茯磚茶經(jīng)“發(fā)花”工序自然形成的一種益生菌，也是“發(fā)花”過程中的優(yōu)勢菌群。在特定的條件下，冠突散囊菌可以在茯磚茶中形成黃色閉囊殼并均勻的附著在茯磚茶中，俗稱“金花”，因此又被稱為“金花菌”。邊疆少數(shù)民族一般以冠突散囊菌的數(shù)量來評(píng)價(jià)茯磚茶品質(zhì)的優(yōu)劣。由于冠突散囊菌的存在，賦予了茯磚茶特有的色、香、味，并且具有促消化、降脂減肥、調(diào)節(jié)糖代謝和抑制腫瘤細(xì)胞、治療心血管疾病等保健功效，其作用機(jī)理還沒有被深入的研究。金黃色的閉囊殼中含有大量黃色物質(zhì)，茯磚茶石油醚洗脫組分中含有大量的色素物質(zhì)，超聲波對(duì)茯磚茶冠突散囊菌色素進(jìn)行了提取，得到了色素精制品，并對(duì)其組分進(jìn)行了初步分析。
以陜西茯磚茶中優(yōu)勢菌冠突散囊菌為試驗(yàn)菌種，采用液體發(fā)酵培養(yǎng)，利用石油醚提取色素并對(duì)其穩(wěn)定性進(jìn)行系統(tǒng)研究，為天然色素的開發(fā)和利用提供科學(xué)依據(jù)和理論基礎(chǔ)，具有良好的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。
1 材料與方法
1.1試驗(yàn)材料
1.1.1供試菌種
冠突散囊菌（Eurotium cristatum）由陜西科技大學(xué)微生物研究室提供。
1.1.2液體發(fā)酵培養(yǎng)基
蔗糖4g、NH4N03 0.1 g、MgS04. 7H20 0.05 g、NaC15 g、水100 m L，121℃滅菌20 min。
1.1.3試劑
石油醚、甲醇，試驗(yàn)藥品均為國產(chǎn)分析純。
1.1.4主要儀器
UV-2600紫外一可見分光光度計(jì)；KH-100B超聲波發(fā)生器等。
1.2試驗(yàn)方法
1.2.1色素的提取
將經(jīng)過7d液體發(fā)酵得到的冠突散囊菌菌絲球用濾紙進(jìn)行過濾并收集菌絲體，低溫烘干。研缽研磨后用有機(jī)試劑石油醚對(duì)色素進(jìn)行提取。提取條件為：冠突散囊菌與石油醚之比為1: 30，超聲提取25min，提取至石油醚溶液沒有顏色（一般為3次），提取后過濾濃縮，把濃縮后的色素石油醚溶液放置在通風(fēng)處自然揮發(fā)干燥，收集干燥后的黃色粉末即為色素粗品。
1.2.2色素含量測定方法
取恒重的色素粗品0.05 g作為試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解并定容至100 m L，配制成500 mg/L色素溶液。將配好的色素溶液稀釋至合適濃度，于200～900 nm掃描，確定其最大即最佳檢測波長λmax
。將上述濃度的色素溶液分別稀釋至50，100，150，200，250，300和350 mg/L的梯度，以甲醇溶液為空白對(duì)照，分別于λmax處測定其吸光度。以色素濃度為橫坐標(biāo)(X，mg/L)、吸光度(Abs)為縱坐標(biāo)作直線，得到色素標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程。根據(jù)回歸方程可以計(jì)算待測樣品在λmax處的吸光度A，即色素的含量。
1.2.3色素降解率的計(jì)算
以色素降解率作為指標(biāo)進(jìn)行冠突散囊菌色素穩(wěn)定性的研究。色素降解率計(jì)算式(1)：
式中：Ct——某時(shí)刻樣品溶液中色素吸光度；C0一樣品溶液中色素初始吸光度。
1.3色素性質(zhì)的研究
稱取一定量的冠突散囊菌色素粗品加入甲醇溶液，配制成一定濃度的色素溶液，使其吸光度在0.2～0.8之間進(jìn)行試驗(yàn)。
1.3.1光照對(duì)色素的影響
取4份等量色素溶液置于100 m L藍(lán)口瓶中，分別放置在太陽光、紫外燈和日光燈下，定時(shí)測定吸光度，以避光條件為對(duì)照。根據(jù)公式計(jì)算降解率，分析不同光對(duì)冠突散囊菌色素的影響。
1.3.2溫度對(duì)色素的影響
冠突散囊菌色素用甲醇溶液稀釋后，分別放置于250 m L容量瓶中，在不同溫度恒溫水浴鍋中進(jìn)行避光水浴加熱6h，冷卻后重新定容，在最大吸收波長處測定其吸光度。根據(jù)公式計(jì)算降解率，分析不同溫度對(duì)冠突散囊菌色素的影響。
1.3.3 pH對(duì)色素的影響
用一定濃度的NaOH和HC1溶液分別將冠突散囊菌菌絲體色素溶液的pH調(diào)節(jié)至2，4，6，8，10和12，在室溫下避光保存，每12 h測定一次吸光度。根據(jù)公式計(jì)算降解率，分析不同pH條件對(duì)冠突散囊菌色素的影響。
1.3.4金屬離子對(duì)色素的影響
配制0.1%的Al3+，M n2+．Zn2+，Mg2+，C a2+，Cu2+，F(xiàn)e3+，F(xiàn)e2+和K+的離子溶液。取等量的色素溶液至25 m L具塞試管中，依次加入金屬離子溶液，對(duì)照為加入去離子水的色素溶液，在室溫下避光保存。根據(jù)公式計(jì)算降解率，分析不同金屬離子對(duì)冠突散囊菌菌絲體色素的影響。
1.3.5食品添加劑對(duì)色素的影響
配制0.02%，0.05%和0.1%的苯甲酸鈉溶液，3 %，5%和7%的蔗糖和葡萄糖溶液。取等量的色素溶液至25 m L具塞試管中，分別加入不同濃度的上述溶液，對(duì)照為加入去離子水的色素溶液，在室溫條件下避光保存，定時(shí)取樣測定其吸光度。根據(jù)公式計(jì)算降解率，分析不同種類、不同含量的食品添加劑對(duì)冠突散囊菌色素的影響。
1.3.6 H202和VC對(duì)色素的影響
配制0.2%，1.0%和3.0%的H202溶液，0.2%，0.5%和1.0%的VC溶液。取等量的色素溶液至25 m L具塞試管中，依次加入上述溶液，對(duì)照為加入去離子水的色素溶液，在室溫條件下避光保存，定時(shí)取樣測定其吸光度。根據(jù)公式計(jì)算降解率，分析不同種類、不同含量的氧化劑、還原劑對(duì)冠突散囊菌色素的影響。
1.3.7酸對(duì)色素的影響
配制0.25%的檸檬酸、酒石酸、草酸、乳酸和磷酸溶液。取等量的色素溶液至25 m L具塞試管中，分別加入上述有機(jī)酸、無機(jī)酸溶液，對(duì)照為加入去離子水的色素溶液，在室溫條件下避光保存，定時(shí)取樣測定其吸光度，計(jì)算降解率，分析不同種類酸對(duì)冠突散囊菌色素的影響。
2結(jié)果與分析
2.1 冠突散囊菌色素性質(zhì)研究方法
2.1.1 色素最大吸收波長的確定
利用紫外一分光光度計(jì)在波長范圍200～600 nm內(nèi)對(duì)冠突散囊菌色素提取液進(jìn)行掃描，確定最大吸收波長，試驗(yàn)測定3次，對(duì)所得結(jié)果取平均值，結(jié)果見圖1所示。
由圖1可知，冠突散囊菌色素在波長200～600 nm范圍內(nèi)存在三個(gè)最大吸收峰，分別為λ1=228 nm，λ2=276 nm和λ3=398 nm，均在紫外區(qū)。有研究顯示．220 nm和280 nm為蛋白質(zhì)的特征吸收峰，而且色素溶液經(jīng)多次重復(fù)掃描，在398 nm處峰形均勻一致，所以可選擇398 nm作為樣品的最大吸收波長。
2.1.2色素含量的測定
由圖2可知，冠突散囊菌色素在濃度50～350 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，其回歸方程為：Y=0.003 6 X-0.015 2，R2=0.999 2。說明利用吸光度來研究色素穩(wěn)定性是合理可行的。
2.2光照對(duì)色素的影響
將冠突散囊菌色素稀釋液分別放置于室內(nèi)光、太陽光和紫外光下，每隔1d定時(shí)取樣測定吸光度，試驗(yàn)測定3次，對(duì)所得結(jié)果取平均值，結(jié)果見圖3。
由圖3可知，太陽光直射對(duì)冠突散囊菌色素穩(wěn)定性影響最大，當(dāng)放置7d后，色素降解率達(dá)28.98%：紫外燈對(duì)色素穩(wěn)定性影響較大，放置7 d后，色素降解率為20.02%；室內(nèi)日光燈對(duì)色素穩(wěn)定性也有一定的影響，開始變化明顯，逐漸減緩，放置7d后，色素降解率為15.48%;避光保存對(duì)色素穩(wěn)定性影響最小，放置7 d后，色素降解率為4.21%。試驗(yàn)說明，強(qiáng)光照射會(huì)對(duì)冠突散囊菌色素穩(wěn)定性產(chǎn)生不利影響，在弱光照射下，冠突散囊菌色素穩(wěn)定性較好，所以應(yīng)該避光保存，禁止長時(shí)間太陽光照射。
2.3溫度對(duì)色素的影響
將冠突散囊菌色素稀釋液分別置于20℃， 40℃，60℃ ，80℃和100℃ 條件下保溫，每隔1 h后測定吸光度，試驗(yàn)測定3次，對(duì)所得結(jié)果取平均值，結(jié)果見圖4。
由圖4可知，室溫保藏下的冠突散囊菌色素穩(wěn)定性較好，放置6 h后色素降解率為3.68%，可以長時(shí)間存放。但是隨著溫度的升高，該色素穩(wěn)定性下降。在60℃以下受熱6h，色素降解率在10%以下；當(dāng)溫度超過60℃后，色素的穩(wěn)定性明顯下降，在100 ℃以下受熱6h，色素降解率達(dá)到32.87%。說明冠突散囊菌色素具有一定的耐熱性，但是在高溫條件下不穩(wěn)定。所以，在保存和使用過程中，應(yīng)該盡量避免高溫和長時(shí)間受熱。
2.4 pH對(duì)色素的影響
利用一定濃度的NaOH和HC1調(diào)節(jié)冠突散囊菌色素提取液的pH，搖勻，靜置0.5 h，觀察其顏色的變化，結(jié)果見表1和圖5。
由表1可知，冠突散囊菌色素提取液pH調(diào)至10時(shí)，溶液顏色由黃色變?yōu)槌壬�，pH調(diào)至12時(shí)，溶液由黃色變?yōu)槌燃t色，且紫外一分光光度計(jì)掃描可以看到最大吸收峰向長波方向移動(dòng)，而pH調(diào)至2～10時(shí)，其最大吸收峰不變，顏色稍微變淺。由圖5可知，色素溶液在避光保存6h后，pH 2～8條件下色素降解率在8%以下，pH為10和12時(shí)則分別為37.65%和45.98%。說明冠突散囊菌色素在酸性、中性和弱堿性條件下較穩(wěn)定，在堿性條件下不穩(wěn)定。2.5金屬離子對(duì)色素的影響
取等體積冠突散囊菌色素溶液分別加入等量不同濃度的金屬離子溶液混合均勻，每隔24 h測定吸光度，試驗(yàn)測定3次，對(duì)所得結(jié)果取平均值，結(jié)果見圖6。
由圖6可知，與對(duì)照組相比，大多數(shù)金屬離子在一定濃度范圍內(nèi)對(duì)突散囊菌色素基本沒有影響，但是Fe3+、Fe2+和Cu2+離子溶液對(duì)色素影響較大，且濃度越大，對(duì)色素穩(wěn)定性影響越大，放置24 h后，色素降解率分別為18.62%，10.43%和26.91%；放置48 h后，色素的降解率分別為27.53%，17.89%和38.46%。所以，在冠突散囊菌色素使用和保存過程中應(yīng)該避免與鐵質(zhì)、銅制容器以及含有Fe3+，F(xiàn)e2+和C u2+的化學(xué)試劑接觸。
2.6食品添加劑對(duì)色素的影響
取等體積冠突散囊菌色素溶液分別加入等量不同濃度的葡萄糖、蔗糖和苯甲酸鈉溶液混合均勻，每隔12 h測定吸光度，試驗(yàn)測定3次，對(duì)所得結(jié)果取平均值，結(jié)果見圖7~圖9。
由圖7~圖9分別可知，與對(duì)照組相比，加入苯甲酸鈉的色素溶液穩(wěn)定性發(fā)生了顯著的改變。放置3d后，加入不同濃度苯甲酸鈉的色素溶液色素降解率分為9.87%，14.32%和18.64%，推測其原因可能是苯甲酸鈉加入后引起了色素化學(xué)結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。所以，冠突散囊菌色素在使用過程中最好避免添加苯甲酸鈉；同時(shí)加入蔗糖溶液的冠突散囊菌色素溶液穩(wěn)定性
變化比加入葡萄糖溶液的大，隨著時(shí)間的推移，變化并沒有進(jìn)一步增大，放置3d后色素的保存率分別為6.86%，7.65%和8.89%，而加入葡萄糖的冠突散囊菌色素降解率則為5.98%．6.63%和7.76%。說明加入這兩種糖冠突散囊菌色素溶液吸光度變化并不顯著，該色素對(duì)糖類有一定的穩(wěn)定性。
2.7 H，0，和VC對(duì)色素穩(wěn)定性的影響
以VC作為還原劑，配制不同濃度的VC水溶液加入到色素稀釋液中，每隔1.0 h測定吸光度，試驗(yàn)測定3次，對(duì)所得結(jié)果取平均值，結(jié)果見圖10。
由圖10可知，隨著VC濃度的增大和作用時(shí)間的延長，冠突散囊菌色素降解率減小，但是變化幅度不顯著，加入0.1%，0.5 %和1.0% VC水溶液的色素溶液在放置3d后，色素降解率分別為4.64%，2.89%和2.34%。說明冠突散囊菌色素具有良好的耐還原性，同時(shí)也表明VC具有很好地護(hù)色作用，所以，冠突散囊菌色素可以與低濃度的還原劑接觸。
以H202為氧化劑，配制不同濃度的H202水溶液加入到冠突散囊菌色素溶液中，每隔1.0 h測定其吸光度，試驗(yàn)測定3次，對(duì)所得結(jié)果取平均值，結(jié)果見圖1 1。
由圖11可知，H，0，的加入對(duì)冠突散囊菌色素穩(wěn)定性有很大的影響，避光保存3d后色素降解率分別為10.91%，19.65 %和27.87%，變化顯著，且氧化劑濃度越大，色素的穩(wěn)定性越差。說明該色素的耐氧化性很差，且隨著氧化劑濃度的增大耐氧化性降低。在不同濃度H202作用下，冠突散囊菌色素溶液顏色逐漸變淺，隨著時(shí)間的推移顏色最終完全消失，所以在使用和保存該色素時(shí)應(yīng)該盡量避免與H202等化學(xué)氧化劑的接觸。
2.8酸對(duì)色素的影響
以無機(jī)酸和有機(jī)酸作為理化因素，配制相同濃度的各種酸溶液，加入到冠突散囊菌色素溶液中，每隔12 h測定其吸光度，試驗(yàn)測定3次，對(duì)所得結(jié)果取平均值，結(jié)果見圖12。
由圖12可知，和對(duì)照組相比較，磷酸對(duì)色素的破壞作用最顯著，在放置3d后，色素降解率達(dá)到33.76%。檸檬酸也有一定的破壞性，色素降解率達(dá)到12.02%，而草酸、乳酸和酒石酸幾乎沒有影響。說明無機(jī)酸對(duì)色素穩(wěn)定性的影響較大，有機(jī)酸的作用比較弱。
3結(jié)論
研究表明，冠突散囊菌色素不溶于水，能溶于有機(jī)試劑，為脂溶性色素。液體發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)液顏色由無色透明變?yōu)榱咙S色，同時(shí)，菌絲體也呈現(xiàn)亮黃色�？芍谕簧⒛揖犬a(chǎn)胞內(nèi)色素，又產(chǎn)胞外色素，以胞內(nèi)色素為主，其主要存在于菌絲體黃色閉囊殼中。試驗(yàn)以胞內(nèi)色素為研究對(duì)象。冠突散囊菌色素甲醇溶液經(jīng)過多次UV-2600紫外一可見光分光光度計(jì)波
長掃描可知，398 nm為其特征吸收峰。試驗(yàn)表明，該色素不耐高溫，太陽光照下易分解，耐酸、不耐堿；金屬離子Fe3+、Fe2+和C u2+對(duì)冠突散囊菌色素有破壞作用，其他金屬離子則無不良影響；蔗糖、葡萄糖對(duì)色素?zé)o影響，苯甲酸鈉和雙氧水有不同程度的破壞，VC對(duì)色素有保護(hù)作用；無機(jī)酸的影響明顯。通過對(duì)冠突散囊菌色素理化性質(zhì)的研究，為冠突散囊菌的進(jìn)一步探索及天然色素的開發(fā)、利用提供科學(xué)依據(jù)和理論基礎(chǔ)，具有良好的經(jīng)濟(jì)效益。
4摘要 以陜西茯磚茶中優(yōu)勢菌群冠突散囊茵為試驗(yàn)菌種，采用液體發(fā)酵培養(yǎng)，利用石油醚提取色素并對(duì)其理化性質(zhì)進(jìn)行研究。結(jié)果表明，冠突散囊菌黃色素的最大吸收波長為398 nm,該色素不耐高溫，600C以下，色素降解率低于10%,超過600C,穩(wěn)定性下降，1000C條件下，保溫6 h色素降解率為32.87%;太陽光照射7d色素降解率達(dá)到28.98%，紫外燈照射7 d色素降解率為20.02%; pH 2～8條件下色素降解率在8%以T，pH 10和12時(shí)降解率分別為37.65%和45.98%，該色素耐酸不耐堿：金屬離子Fe3+、Fe2+、Cu2+對(duì)冠突散囊菌色素有破壞作用，放置48 h后，色素的降解率分別為27.53%、17.89%和38.46%,其他金屬離子則無不良影響；蔗糖、葡萄糖濃度對(duì)色素?zé)o影響而VC有護(hù)色作用；苯甲酸鈉、無機(jī)酸和雙氧水均有破壞性，放置48 h，色素降解率均超過20%。
