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作者：鄭曉敏

       高良姜（Alpinia officinarum Hance）為姜科( Zingiberaceae)植物高良姜的干燥根莖。高良姜是藥食同源的一種植物，不僅在醫(yī)藥上有著很好的藥理活性，而且在食品上被廣泛的應(yīng)用。國(guó)內(nèi)外一些學(xué)者對(duì)高良姜中高良姜素槲皮素?fù)]發(fā)油等提取工藝進(jìn)行了研究，并將高良姜應(yīng)用到了菠菜芒果等蔬菜、水果的防腐保鮮上，對(duì)活性成分、藥效進(jìn)行了研究。為了更好的對(duì)高良姜抑菌活性成分進(jìn)行研究．提高其作為防腐劑的應(yīng)用范圍。試驗(yàn)對(duì)高良姜抑菌物質(zhì)的提取進(jìn)行了方法的篩選，并對(duì)影響因素及條件進(jìn)行了優(yōu)化，意在提高其經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

1  材料與方法

1.1材料與儀器

    高良姜（Alpinia officinarum Hance）：購(gòu)于湛江徐聞。

    無(wú)水乙醇、無(wú)水甲醇、丙酮、乙酸乙酯、石油醚（沸程60℃-90℃）均為國(guó)產(chǎn)分析純；金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、乙型副傷寒沙門氏菌( Beta paratyphoid Salmonella)、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、蠟樣芽孢桿菌（Bacilluscereus）、蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）、大腸桿菌（Escherichia coli）、副溶血性弧菌（Vibrioparahaemolyticus）、希瓦氏菌（Hawanella putrefacens），由廣東海洋大學(xué)食品加工與安全重點(diǎn)微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

    GZX-9240 MBE型數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；BL-620S型電子分析天平：日本Shimadzu公司；EYEL4 SB-IIOO型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海愛(ài)朗儀器有限公司；SiCMA 3-18K型高速冷凍離心機(jī)：德國(guó)進(jìn)口；SW-CJ-2D型凈化工作臺(tái)：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；LS-B50L立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1材料預(yù)處理

    高良姜根莖一清洗切片一烘干( 50℃)一粉碎（50目）-冰箱保存(4℃)

1.2.2提取液的制備

    1)索氏抽提法：對(duì)黃慧珍的方法進(jìn)行改進(jìn)，得到濃縮液。于-20℃冰箱預(yù)冷，在超低溫冰箱-80℃過(guò)夜，采用真空冷凍干燥機(jī)干燥，稱重、計(jì)算得率，取冷凍干燥后的粉末制成0.1 g/mL的提取液。

    2)超聲波輔助提取法：稱取粉末5 9，放人250 mL的錐形瓶中，石油醚提取3次，每次加入150 mL并于超聲波清洗器中開機(jī)處理l h，把3次的提取液合并過(guò)濾，得濾液。

  3)微波輔助提取法：稱取粉末5 9，放入250 mL的錐形瓶中，石油醚提取3次，每次加入150 mL置于微波爐中處理30 s，把3次的提取液合并過(guò)濾，得濾液。

1.2.3菌懸液的制備

  斜面接種供試菌種，培養(yǎng)溫度為37℃，培養(yǎng)時(shí)間24 h。各挑取供試菌種一環(huán)，移人已經(jīng)高溫滅菌的LB肉湯中，培養(yǎng)16-18 h，進(jìn)行系列10倍梯度稀釋，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。使菌懸液的濃度達(dá)到108 CFU/mL。

1.2.4抑菌活性試驗(yàn)

  采用雙層平板法，生化培養(yǎng)箱37℃，培養(yǎng)18-24 h，每種菌平行試驗(yàn)3次，不加菌的試劑做空白對(duì)照。采用十字交叉法，用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑。

1.2.5單因素試驗(yàn)

  分別將乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取次數(shù)、提取時(shí)間、料液比、浸提時(shí)間和提取功率進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

1.2.6響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

    在單因素的基礎(chǔ)上進(jìn)行了響應(yīng)面設(shè)計(jì)，水平因素見(jiàn)表l。

2結(jié)果與分析

2.1不同方法的選擇

    在提取溶劑與濃度一定的條件下，采用3種方法對(duì)高良姜抑菌物質(zhì)進(jìn)行提取，抑菌試驗(yàn)結(jié)果如表2�？芍�，索氏抽提方法：枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、副溶血性弧菌、沙門氏菌都不顯著；超聲波輔助提取，枯草芽孢桿菌、沙門氏菌、希瓦氏菌顯著性不可以區(qū)分，大腸桿菌、副溶血性弧菌顯著性不可以區(qū)分；微波輔助提取除了蘇云金芽孢桿菌和副溶血性弧菌

不可以區(qū)分，剩下的菌顯著性明顯，另外對(duì)于金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌兩種指示菌來(lái)說(shuō)，微波輔助提取的抑菌圈直徑最大，分別為14.96±0.06 mm、19.28±0.17 mm。因此選擇微波輔助提取方法作為提取高良姜抑菌物質(zhì)的最佳方法。

2.2單因素試驗(yàn)

2.2.1  最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)的選擇

    從圖1看出，高良姜提取物的抑菌能力隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的變化而變化，對(duì)于金黃色葡萄球菌，從乙醇體積分?jǐn)?shù)30%-80%，抑菌能力是逐漸上升的，800-/0-1 000-10開始變化，800-/0時(shí)金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑達(dá)到最大值是17.28±0.32 mm，這可能與極性有關(guān)，由于一些醇溶性雜質(zhì)、親脂性、色素等成分的大量溶出，從而導(dǎo)致抑菌效果減弱‘14]。對(duì)于蠟樣芽孢桿菌，在30%-500-/0是逐漸上升的，50%-700-/0略微下降，到90%達(dá)到最高值19.40±0.24 mm，而后下降。

2.2.2最佳提取次數(shù)的選擇

   從圖2可知，提取次數(shù)與抑菌能力成負(fù)相關(guān)。一次浸提后有效成分己基本提取完畢，多次浸提會(huì)增加雜質(zhì)量，影響有效成分的浸出。第一次提取率76.63%，第二次為14.23%，第三次為5.16%，綜合提取率及抑菌活性可得出提取2次得率最高，抑菌活性一次為最佳。

2.2.3最佳提取時(shí)間的選擇

    從圖3可知，抑菌物質(zhì)的抑菌效果隨著微波提取時(shí)間的延長(zhǎng)，蠟樣芽孢桿菌呈現(xiàn)出先上升后急劇下降的趨勢(shì)，蠟樣芽孢桿菌在20 s的時(shí)間時(shí)抑菌效果能力最強(qiáng)：17.16±0.32 mm；黃色葡萄球菌是先下降后急劇上升，再出現(xiàn)波動(dòng)，黃色葡萄球菌在提取時(shí)間為30s時(shí)抑菌效果最好，是18.64±0.12 mm。原因可能是：隨著時(shí)間的增加，溶液溫度迅速升高，抑菌物質(zhì)的溶解度得到了飽和，從而出現(xiàn)了抑菌活性先增大而后下降的趨勢(shì)。有效成分長(zhǎng)時(shí)間受熱也可能導(dǎo)致生物活性的破壞，大量的雜質(zhì)影響抑菌結(jié)果。

2.2.4最佳料液比的選擇

    從圖4可知，提取物的抑菌能力隨料液比的增加呈下降又上升再下滑的趨勢(shì)。料液比在1：10-1：15( g/mL)時(shí)，抑菌圈直徑急劇下降，蠟樣芽孢桿菌16.26 mm下降到14.18 mm．黃色葡萄球菌由19.26 mm下降到17.18 mm;1：15-1：20 (g/mL)呈急速上升趨勢(shì)，在1：20(g/mL)時(shí)兩種抑菌圈直徑得到最大：20.32 mm，17.44 mm，隨料液比的增加，有效，分浸出加快，當(dāng)料液比大于1：20( g/mL)之后，．菌圈直徑急劇下降。選取1：20( g/mL)左右為最一料液比。

2.2.5最佳提取功率的選擇

    從圖5可得，功率為300 W時(shí)，金黃色葡萄，菌、蠟樣芽孢桿菌的抑菌活性都得到了最大值分別11.68，16.42 mm。功率過(guò)低，微波的穿透力較弱物料溫度偏低，分子運(yùn)動(dòng)減慢，減弱了有效成分的出。功率過(guò)高，很可能導(dǎo)致有效成分結(jié)構(gòu)的破壞，終選擇功率為300 W。

2.2.6最佳浸提時(shí)間

    從圖6得出，0-2 h，抑菌圈直徑下降，開始溶解不夠充分，抑菌圈直徑減�。辉�2-6 h內(nèi)抑菌圈直徑逐漸上升，蠟樣芽孢桿菌4h時(shí)到達(dá)最大值20.62 mm，在6h時(shí)黃色葡萄球菌達(dá)到最大值18.24 mm，浸提時(shí)間超過(guò)6h后，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，急速下降。在浸提過(guò)程中浸出時(shí)間越長(zhǎng)，則浸出物的浸出越充分、越完全，從表面上看似乎是有利的，但時(shí)間延長(zhǎng)會(huì)使各方面消耗增加，有效成分長(zhǎng)時(shí)間受熱會(huì)導(dǎo)致生物活性的破壞，大量雜質(zhì)成分溶出，結(jié)果并不樂(lè)觀。

2.3響應(yīng)面優(yōu)化工藝

2.3.1  響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

    對(duì)影響較大的三個(gè)因素做了響應(yīng)面分析，采用了JMP 7.0軟件進(jìn)行了設(shè)計(jì)。以黃色葡萄球菌為指示菌。在單因素基礎(chǔ)上，采用了JMP軟件中Box-Behnken模型，選取了提取時(shí)間（X）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（X）、浸提時(shí)間（X3）進(jìn)行了三因素、三水平的響應(yīng)面設(shè)計(jì)，最大抑菌圈直徑為響應(yīng)值(Y)，結(jié)果見(jiàn)表3。

 2.3.2響應(yīng)面模型分析

    根據(jù)F值大小可以得到各變量對(duì)高良姜提取物         的影響順序?yàn)椋阂掖俭w積分?jǐn)?shù)（X2）>浸提時(shí)間（X3）>提取時(shí)間（墨）。但都不顯著。二項(xiàng)式X．2

( 0.007)，X22( 0.003)，X32( 0.004)的p值都得到了極顯著水平(<0.01)，XIX2項(xiàng)、X2X3項(xiàng)、XIX3pfa均>0.05為不顯著．說(shuō)明提取時(shí)間、乙醇體積數(shù)、浸提時(shí)間不顯著。從p值可以看出提取時(shí)間與醇體積分?jǐn)?shù)、浸提時(shí)間的交互作用強(qiáng)于乙醇體積分，與浸提時(shí)間的交互作用。

2.3.3  響應(yīng)面圖分析

    從響應(yīng)面三維圖可以直觀的反應(yīng)各因素對(duì)響應(yīng)值的影響程度及交互作用的強(qiáng)弱。圖7-圖9知，一定范圍內(nèi)，當(dāng)提取時(shí)間一定時(shí)抑菌能力隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大而增大，存在最大值，乙醇體積分?jǐn)?shù)一定時(shí)，抑菌圈能力隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增大，存在最大值。即提取時(shí)間與乙醇體積分?jǐn)?shù)交互作用圖存在頂點(diǎn)，等高線為橢圓型，在提取時(shí)間為24-26。、乙醇體積分?jǐn)?shù)在72%-780-/0范圍內(nèi)響應(yīng)值較大；乙醇體積分?jǐn)?shù)一定，隨著浸提時(shí)間的延長(zhǎng)，抑菌圈直徑逐漸減小，趨勢(shì)較為平滑；浸提時(shí)間一定，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，抑菌圈直徑逐漸增大趨勢(shì)較為陡峭，存在交點(diǎn)。與模型預(yù)測(cè)一致，乙醇體積分?jǐn)?shù)與浸提時(shí)間的交互作用弱于乙醇體積分?jǐn)?shù)與提取時(shí)間的交互作用；浸提時(shí)間一定時(shí)，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，抑菌能力是逐漸增大的，而后減小，說(shuō)明隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，有效成分的浸出可能是先增多后雜質(zhì)增多，從而影響抑菌能力，存在極大值；提取時(shí)間一定時(shí)，隨著浸提時(shí)間的延長(zhǎng)，抑菌物質(zhì)的能力是先減小后增大，可能與物料與溶劑的接觸面積有關(guān)，從等高線上可以看出，圖形為非橢圓，與模型中預(yù)測(cè)的交互作用不顯著相一致。

2.3.4最佳工藝和驗(yàn)證試驗(yàn)

    由jMP軟件分析得到微波輔助提取高良姜抑菌物質(zhì)的最佳工藝：微波功率300 W，提取時(shí)間25.23。，浸提時(shí)間4h，乙醇體積分?jǐn)?shù)73.26qo，料液比1: 20( g/mL)，提取次數(shù)1次，在此條件下高良姜提取物對(duì)黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為17.75 mm，轉(zhuǎn)折條件提取時(shí)間24.85 s，乙醇體積分?jǐn)?shù)75.77%，浸提時(shí)間3.94 h，此條件下抑菌圈直徑是16.56 mm。由于試驗(yàn)條件的限制，適當(dāng)調(diào)整為微波功率300 W，料液比1：15(g/mL)，乙醇體積分?jǐn)?shù)75%，提取次數(shù)1次，浸提時(shí)間4h，此時(shí)的理論抑菌圈直徑為16.56 mm，經(jīng)過(guò)驗(yàn)證試驗(yàn)，實(shí)際的抑菌去圈直徑為16.44±0.07 mm相對(duì)誤差為0.7%。說(shuō)明該模型可以應(yīng)用于高良姜抑菌物質(zhì)的提取，

3結(jié)論

國(guó)外已有利用微波輔助萃取薄荷精油、香柏油、芹菜腦、大蒜油等天然香料成分的專利。目前，國(guó)內(nèi)利用此法已實(shí)現(xiàn)對(duì)佩蘭、香葉天竺葵、木香植物揮發(fā)油成分的提取。微波輔助提取能有效的提取高良姜的抑菌物質(zhì)，具有效率高、時(shí)間短、耗能少等優(yōu)點(diǎn)。試驗(yàn)經(jīng)分析得出的高良姜抑菌物質(zhì)提取的最佳工藝：微波提取功率300 W，乙醇體積分?jǐn)?shù)75%，料液比120(g/mL)，提取時(shí)間25 s，浸提時(shí)間4h，提取次數(shù)1次，此工藝條件可以為高良姜抑菌物質(zhì)進(jìn)一步研究和綜合利用提供一定的參考及指導(dǎo)。

4摘  要 

 為找出高良姜抑菌活性物質(zhì)提取的最佳方法，采用索氏抽提法、超聲波輔助提取、微波輔助提取三種方法對(duì)高良姜抑茵活性物質(zhì)進(jìn)行提取，比較得出微波輔助提取其抑菌物質(zhì)是最佳的方法。在單因素的基礎(chǔ)上，篩選出影響較大的三個(gè)因素：提取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、浸提時(shí)間。并采用響應(yīng)面法優(yōu)化了提取工藝。通過(guò)JMP軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果表明微波輔助提取高良姜抑菌物質(zhì)的最佳工藝為：微波功率300 W，料液比1：20 (g/mL)，乙醇體積分?jǐn)?shù)75%，提取時(shí)間25 s，浸提時(shí)間4h，提取次數(shù)1次。