測定菌落總數(shù)和大腸菌群的兩種方法
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作者：鄭曉敏
食品微生物檢測目前仍主要依賴傳統(tǒng)的培養(yǎng)、分離及生化鑒定法，耗時費力，缺乏時效性及簡便性，難以滿足對食品行業(yè)工業(yè)化流水作業(yè)進行實時監(jiān)控并及時排除隱患的需求。微生物測試紙片正是應(yīng)快速檢測的市場需求而生的一款集高效、簡便、精確、靈敏等優(yōu)勢為一體的新興檢測產(chǎn)品。通過將特定的培養(yǎng)基及顯色基質(zhì)附著于紙片、膠片及紙膜等載體上，紙
片法省去了傳統(tǒng)方法中培養(yǎng)基配制、平板制備等繁瑣的程序，其特異的顏色反應(yīng)也有效克服了普通培養(yǎng)基上菌落形態(tài)特征不明晰等缺陷，是現(xiàn)代食品微生物檢測的理想之選。
目前國內(nèi)市場用的微生物快速檢測紙片多為美國3M、日本NISSUI等進口品牌，價格昂貴。近年來，隨著國家對食品安全檢測的日益重視，國內(nèi)許多生物科技公司也開始陸續(xù)開發(fā)相關(guān)的干片產(chǎn)品，其價格優(yōu)勢顯著，為檢測機構(gòu)及相關(guān)食品企業(yè)提供了更多的選擇。為了更好地為受眾選擇合適的檢測產(chǎn)品提供一定的借鑒和參考，試驗比較了國產(chǎn)和進口兩個代表性測試干片產(chǎn)品與傳統(tǒng)培養(yǎng)法在菌落總數(shù)及大腸菌群計數(shù)中的表現(xiàn)，包括計數(shù)結(jié)果、成本、簡易性、菌落辨識度等性能。
1 材料與方法
1.1試驗儀器與設(shè)備
一次性移液管：JET BIOFIL；電動移液器：Jen-cons；一次性塑料培養(yǎng)皿：JET BIOFIL；錐形瓶：四川蜀玻；滅菌試管：上海五一；拍擊式樣品均質(zhì)器BagMixer:法國Interscience；高壓蒸汽滅菌鍋：日本Hirayama；隔水式恒溫培養(yǎng)箱：上海精宏。
1.2主要試劑
稀釋液：磷酸鹽緩沖液（北京陸橋）；復蘇培養(yǎng)液：營養(yǎng)肉湯（北京陸橋）。
傳統(tǒng)培養(yǎng)法所用培養(yǎng)基：平板計數(shù)瓊脂、結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂( VRBA)和煌綠乳糖膽鹽(BGLB)肉湯：均購自北京陸橋，根據(jù)產(chǎn)品說明配制、滅菌、使用。
快速測試紙片：菌落總數(shù)測試紙片和大腸菌群測試紙片（國產(chǎn)及進口品牌各一）。
1.3試驗方法
分別選取日常檢測中衛(wèi)生指標菌（指菌落總數(shù)和大腸菌群）污染低、中、高的固、液食品各一份，以國標法和紙片法（2種）分別測定其菌落總數(shù)及大腸菌群，分析比較計數(shù)結(jié)果；同時，采用實驗室保存的大腸埃希氏菌( CMCC 44113)作為驗證試驗的材料，加標于經(jīng)滅菌處理的白饅頭中作為檢測對象，對三種檢測方案的計數(shù)結(jié)果、菌落辨識度、簡便性及檢測成本等指標進行綜合評價。
1.3.1菌株復蘇
取保存于-80 0C的大腸埃希氏菌，接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液中，于37℃靜置培養(yǎng)至麥氏濁度1.5左右。
1.3.2模擬加標樣本制備
取復蘇后的原始菌液1 mL加入25 g白饅頭中，作為模擬檢樣。
1.3.3菌落總數(shù)和大腸菌群測定
參照GB 4789.2_2010、GB 4789.3_2010（第二法）執(zhí)行．即取檢樣25 g或25 mL加入225 mL磷酸鹽緩沖液，充分拍擊均質(zhì)，取上清液1 mL，以磷酸鹽緩沖液做10倍連續(xù)梯度稀釋，取三個合適的稀釋度，分別用紙片法和傳統(tǒng)傾注平板計數(shù)法進行菌落總數(shù)和大腸菌群計數(shù)，于36℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h（菌落總數(shù)）和24 h（大腸菌群），每組測試做三個平行重
復，比較三種檢測方法的數(shù)據(jù)平行性，以統(tǒng)計學方法進行顯著性分析。
2結(jié)果
2.1計數(shù)結(jié)果
如表l所示，傳統(tǒng)培養(yǎng)法與兩款紙片產(chǎn)品在供試實際及模擬樣本的菌落總數(shù)和大腸菌群的計數(shù)結(jié)果上呈現(xiàn)高度平行性，方差分析結(jié)果顯示兩個衛(wèi)生指標的各數(shù)值間均無統(tǒng)計學差異(p>0.05)。
2.2菌落辨識度
稀釋樣液加入傳統(tǒng)培養(yǎng)基或紙片于36℃培養(yǎng)后，其菌落形態(tài)呈現(xiàn)一定的差異（圖1）。其中平板計數(shù)瓊脂上菌落呈白色菌落，邊緣清晰，其中位于培養(yǎng)基表面的為中心白點外擴至直徑約2 cm的圓形菌落，而位于培養(yǎng)基內(nèi)層的菌落則呈小白點狀；進口菌落總數(shù)測試紙片上的菌落呈邊緣清晰可辨的紅色圓形菌落，而國產(chǎn)紙片上的紅色菌落則個體邊緣模糊、不規(guī)則甚至拖尾。
大腸菌群在VRBA平板上呈紫紅色且周圍有紅色膽鹽沉淀環(huán)的圓形菌落，邊緣清晰；進口紙片上的大腸菌群呈紅色、帶氣泡狀，清晰可辨；國產(chǎn)大腸菌群測試紙片上的菌落亦呈現(xiàn)類似于其在菌落總數(shù)快速測試干片上的形態(tài)，邊緣模糊、拖尾。
2.3簡便性
GB傳統(tǒng)培養(yǎng)法需要經(jīng)過培養(yǎng)基配制及滅菌等準備程序以及后期培養(yǎng)皿清洗等善后工作，相對于商品化的測試干片產(chǎn)品耗時費力；配制好的培養(yǎng)基最好盡快使用，其放置于4℃的保存的時間亦不宜過長，而本研究所涉兩品牌測試紙片的有效期均長達1年之久，方便隨時取用：此外，相對于進口大腸菌群測試片，國產(chǎn)紙片無法指示產(chǎn)氣特性，需補充BGLB發(fā)酵以判定是否產(chǎn)氣的確證試驗，在一定程度上折損了其簡易性。
2.4成本
就試驗所涉的三組材料分別進行成本核算，結(jié)果顯示（表2），進口紙片法檢測一個樣本的菌落總數(shù)和大腸菌群的成本分別約為85元和96元，為國產(chǎn)紙片法和傳統(tǒng)培養(yǎng)法的2和7倍：而國產(chǎn)紙片檢測成本則僅略高于GB法約3倍。但值得一提的是，采用紙片法時培養(yǎng)所需空間小，相對于平板培養(yǎng)法可大大節(jié)約空間成本。
3討論
研究比較了快速測試紙片和傳統(tǒng)培養(yǎng)法用于測定實際及模擬食品樣本中菌落總數(shù)和大腸菌群的效果，綜合評價了包括計數(shù)結(jié)果、菌落辨識度、操作簡便性及檢測成本在內(nèi)的4個指標。以日常檢測中衛(wèi)生指標菌染菌數(shù)高、中、低的固、液體實際食品樣本6份及模擬加標樣品l份為檢測對象，計數(shù)結(jié)果顯示兩種測試方法無統(tǒng)計學差異，高度吻合。干片法用于菌落總數(shù)和大腸菌群計數(shù)的可靠性業(yè)已在食品與空氣沉降菌總數(shù)、餐具大腸菌群計數(shù)等多項研究中被廣泛證實。另外，相對于傳統(tǒng)培養(yǎng)法，干片法可省去繁雜的前期準備及后期清潔、廢棄處理等程序，有效簡化操作，并節(jié)約培養(yǎng)所需的空間。同時，進口紙片在菌落辨識度上顯著優(yōu)于傳統(tǒng)方法和國產(chǎn)紙片，尤其適用于復雜基質(zhì)樣本的檢測。但是，商品化干片測試產(chǎn)
品（尤其是進口產(chǎn)品）的檢測成本也遠高于傳統(tǒng)培養(yǎng)法。
綜上所述，用戶可綜合考慮成本、操作簡易度及檢驗結(jié)果可讀性及科學性等因素選擇合適的檢驗方法，以獲得最優(yōu)信價比的高效檢測。
4摘要
比較了國產(chǎn)及進口兩個品牌的菌落總數(shù)及大腸菌群測試片與傳統(tǒng)國標法計數(shù)結(jié)果的符合度，并對干片產(chǎn)品較之傳統(tǒng)培養(yǎng)法的茵落特征辨識度、操作簡便性及檢測成本等關(guān)鍵指標進行對比評判。結(jié)果顯示，三者在所測兩種基本衛(wèi)生指標的計數(shù)結(jié)果上呈現(xiàn)高度平行性p>0.05），快速紙片法可簡化程序但成本高，使用者可根據(jù)實際工作需要結(jié)合使用；而在茵落辨識度上進口紙片呈現(xiàn)顯著優(yōu)勢，尤其適用于復雜基質(zhì)樣本的檢測。
